192536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás l9-epidianemicin előálítására
1 192 536 2 vegő a folyadék térfogatára vonatkoztatva. Amikor a fermentáció befejeződött — a vizsgálati módszer: antibiotikus korong vizsgálat B. subtilis ATCC 6633-mal szemben — a fermentorokat leállítjuk, semleges pH-n diatómaföld hozzáadásával leszűrjük. A szűrőpogácsát metanollal szuszpendáljuk, szűrjük, az oldószert vákuumban bepároljuk, 2—3 térfogat vízzel hígítjuk, majd kétszer 1/3—1/2 térfogatnyi oldószerrel, így metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Az oldószeres fázist szívással vagy centrifugálással elválasztjuk a vizes fázistól, és vákuumban viszkózus olajkonzisztencia eléréséig pároljuk. Az antibiotikumot úgy is izolálhatjuk, hogy az egész táptalajt semleges pH-n metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, és az oldószert viszkózus olaj konzisztencia eléréséig koncentráljuk. Az olajat heptánban szuszpendáljuk, és szilikagél 60 hozzáadásával a következőképpen kezeljük: A szilikagél-pogácsát kloroformmal, .majd kloroform/etil-acetát elegyével, végül etil-acetáttal eluáljuk. Koncentrálás után az etil-acetátos frakcióból nyersterméket kapunk, amelyből a 19-epi-dianemicint vegyes nátrium/kálium sója formájában kristályosítjuk ki. A nyerstermék vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata az alábbi rendszerekben — amelyek mindegyike alkalmas a dianemi cin és a 19-epi-diamemicin elválasztására — csak a 19-epi-dianemicin jelenlétét mutatja. Rendszer Rf Rf dianemicin 19-epi-dianemicin etil-acetát 0,30 0,40 kloroform-aceton (1:1) 0,42 0,49 etil-acetát kloroform (2:1) 0,15 0,22 Hasonló eredményeket kapunk, ha a példában alkalmazott közeget az alább leírt közegek bármelyikével helyettesítjük: C közeg gfliter Keményítőcukor 10,0 kukoricakeményítő 10,0 szójaliszt 10,0 kukorica koncentrálható szilárd anyaga 5,0 nátrium-klorid 5,0 kalcium-karbonát 1,0 víz 1 literhez pH = 6,9—7,0 M közeg g/liter Keményítőcukor í 0,0 keményítő 20,0 élesztőextraktum 5,0 kobalt-klorid 0,002 NZ Amin A 5,0 kalcium-karbonát 1,0 víz 1 literhez pH = 6,9—7,0 2. példa Arányosan megnövelve az 1. példában leírt meninyiségéket, az 1. példa szerinti eljárást egy nagy fermentorban hajtjuk végre, 0,7 liter CL13M közeget tartalmazó rázólombikokat használva inokulumként. A rázólombikos inokulumot 3—5 napig 28 °C hőmérsékleten fermentáljuk, és olyan 6434,5 literes fermentort oltunk be vele, ami 4542 liter CL13M közeget taralmaz. Az inokulumból körülbelül 1 litert (0,05°/0) használunk fel a fermentorhoz. 4-napos ferlmentáció után a fermentor tartalmát (körülbelül 4164 liter) feldolgozzuk. Az egész 'táptalajt semleges pH- n 1 '5 térfogat metil-dzobutil-ketonnal extraháljuk, Podbielniack szeparátorral elválasztjuk és az oldószert vákuumban olajos maradék eléréséig pároljuk (30,3 liter). Az olajat egy ciklon bepárlóban tovább pároljuk, amíg szirupszerű anyagot kapunk. Ezután ezt heptánban szuszpendáljuk, szilikagéllel keverjük össze (Merck 60-as szilikagél), majd szilikagél ágyon átszűrjük és ismételten átmossuk heptánnal. Az antibiotikumot egymás után kloroformmal, kloroform/ etil-acetát elegyével, majd etil-acetáttal, és végül 50% acetont tartalmazó etil-acetáttal eluáljuk. Az eluálás után a frakciókat vékonyrétegfcromatografáljuk és biológiai vizsgálatnak vetjük alá. Az aktív frakciókat egyesítjük, koncentráljuk és az antibiotikum izolálása oéljából újra kromatograf áljuk. A feldolgozás alatt problémák jelentkeztek az aktív frakcióknak a szilikagél ágyról való kinyerésével. Ezen úgy segített, hogy az aktív eluátumokat granulált Daroo szénen szűrtük át, ami eltávolította a szennyező anyagokat és javította a kinyerést. Ily módon körülbelül 40 g kristályos 19-epi-dia nemicint kaptunk. 3. példa A 2. példában leírtak szerint eljárva, egy körülbelül 4164 literes fermentorban S. hygroscopicus ATCC 39205 fermentációt hajtottunk végre. Az egész táptalajt 1/5 térfogat metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, majd az extraktumot vákuumban barna olajig koncentráljuk (körülbelül 3,79 liter). A konoentrátumot 11,4 liter kevert heptánba öntjük, és a kapott iszapos anyagot diatómaföldágyon .szűrjük ét. A szűrletet adagonként Merck 60 szilikagéllel (70—230 finomság) kezeljük. A szilikagélt egymás után 11,4 liter heptánnal, kloroformmal, acetonnal és metanollal mossuk. A frakciókat vékonyrétegkromatográf iával vizsgáljuk, a 19-epá-dianemicint főként az acetones és a kloroformos frakciókban találjuk. Az acetones frakciót (180 g) 8x100 cm-es oszlopon kromatograf áljuk. A töltet Merck 60 szilikagél (230—400 finomság). Az eluáló oldószer etil-iacetát. ,Az átfolyás sebessége 70 ral/perc és körülbelül 1 literes frakciókat veszünk. A frakciókat vékonyrétegkromatográf iával vizsgáljuk Analtech GF szili'kagéles lemezeken, etil-acetáttal futtatva. A lemezeket úgy hívjuk elő, hogy vanillin reagenssel (3 g vanillin 75 ml etanolban és 25 ml 85%os foszforsavban oldva) befújjuk, majd 80 °C hőmérsékletre melegítjük őket. A 19-epi-dia-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
