192536. lajstromszámú szabadalom • Eljárás l9-epidianemicin előálítására
1 192 536 2 sen, hogy a fermentációs táptalaj térfogatára nézve körülbelül 1/2—2 térfogat íSteril levegőt áramoltatunk át a táptalajon egy levegőeloszlató segítségével. A keverést a fermentációs irodalomban ismert, ikeverőik bármelyikével biztosíthatjuk. A keverés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. Egy rázólombik általában 150—200 percenkénti fordulatszámmal forog, míg egy fermentor percenként általában 300—1700 fordulattal. Természetesen fontos az aszeptikus körülmények fenntartása az egész tenyésztés alatt. A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikum előállításához szükséges oltóanyagot úgy nyerjük, hogy az N-483-29 tenyészettel beoltott ferde tenyészetről vagy Roux palackról ledörzsöljük a vegetatív sejteket. A ferde tenyészeten vagy Roux palackon induló növekedéshez szükséges szilárd közeg ATCC4Í172 közeg. ATCC 172 Glükóz Oldható keményítő Élesztőextraktum NZ Amin A Kalcium-karbonát Desztillált víz qramm/liter 10 20 5 5 1 1000 ml-re a pH-érték 7,0 kálium-hidroxiddal beállítva Agár 20 A ferde tenyészetből származó vegetatív sejteket egyaránt felhasználhatjuk rázólombikok vagy inokulum fermentorok beoltásához: az inokulum fermentorokat beolthatjuk rázólombikokból is. Rázólombikokban a növekedés maximális értéke általában 96—120 óra alatt érhető el, míg inokulum fermentorokban a növekedés rendszerint 72—96 óra alatt éri el legelőnyösebb periódusát. A fermentort a rázólomibiikokból vagy inokulum fermentorokból származó, élő sejteket tartalmazó oltóanyaggal teljesen aszeptikus körülmények között oltjuk be, a fermentációt 96—168 óráig végezzük. A levegőztetést a rázólombikban keveréssel, a fermentorhan pedig steril levegő átáramoltatásával biztosítjuk. Az átáramló levegő mennyisége percenként 1 2—2 térfogat, a táptalaj térfogatára számítva. A keverés sebessége az alkalmazott keverő típusától függ. A hőmérsékletet 24 °C és 36 CC között tartjuk. A fermentáció befejeződése után az antibiotikumot úgy nyerjük ki, hogy a táptalajt valamilyen vízzel nem elegyedő oldószerrel, például n-butanollal, metil-izobutil-ketonnal, etil-acetáttal vagy kloroformmal extraháljuk 4,0—8,0 pH-éPtéken. Hasonló módon a mioéliumot is elkülönítjük és az előbb felsorolt oldószerek valamelyikével extraháljuk az antibiotikum izolálása céljából. Az extraiktumot koncentráljuk, a konoentrátumot heptánban oldjuk és szilikagélen kromatografáljuk. A fermentáció alatt az antibiotikum termelődés előrehaladását és a fermentációs táptalaj bioaikitivitását a táptalaj biológiai vizsgálatával ellenőrizhetjük, egy érzékeny Staphy-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 lococeus aureus vagy Bacillus subtilis törzs felhasználásával. Erre a célra megfelel az S. aureus ATCC 6538 és a B. subtilis ATCC 6633 törzs. Standard lemezes vizsgáló módszert alkalmazunk, amelynél a 'táptalajjal átitatott szűrőpapír gyűrű által körülvett gátló zónát használjuk az antibiotikus hatóképesség mértékéül. Szilikagéles vékonyrétegkromatográfia is használható a fermentációs közegben termelődött antibiotikum és a fermentációs táptalajból extrahált nyers és tisztított anyagok összetételének analizálására. Az Analtech GF sziliikagél kramatogramakat etil-acetát metanollal (9:1) vagy kloroform/ metanollal (9:1) futtatjuk. Az antibiotikumot oly módon hívhatjuk elő, hogy a lemezt vanillin reagenssel (3 g vanillin 75 ml etanolban és 25 ml 85%-os foszforsavban) fújjuk be, és 80 °C hőmérsékletre melegítjük. Az antibiotikum bíborpiros foltként tűnik elő. Az antibiotikum előhívását elvégezhetjük úgy is, hogy a lemezt S. aureus-szal vagy B. subtilis-szel beoltott agarral vonjuk be, amelyhez 2,3,4-trifenil-2H-tetrazoliumklorid-monohidrátot adtunk, és 37 °C-on 16 óra hosszat inkubáljuk. Ekkor az antibiotikum rózsaszín háttérben fehér foltként jelentkezik. A találmány szerinti eljárással előállított 19-epi-dianemicin antibiotikum gátló hatást mutat számos Gram-pozitív mikroorganizmussal szemben. A vizsgálatban a mikroorganizmusokat olyan kémosősorozatba oltottuk, amelyek a tápközeget és különböző koncentrációban 19- -epi-dianemicint tartalmaztak. A vizsgálat annak a minimális antibiotikum koncentrációnak a meghatározására .szolgál mcg/mlben, amely 24 óra alatt meggátolja a mikroorganizmus szaporodását. (MIC = minimális gátlókoncentráció). A 19-epi-dianemicin és kationos sói kiváló aktivitást mutatnak a baromfik kokcidiális fertőzéseivel szemben. A csiikék táplálékába 50—200 ppm mennyiségben bekeverve, ezek a vegyületek hatékonyak az Eimeria tenella, E. acervulina, E. maxima, E. brunetti és E. neoatrix okozta fertőzésekkel szemben. A 19-epi-dianemioinnek és sóinak csirkék kokoidiumos fertőzéseivel szemben mutatott hatékonysági adatait a következő módon kaptuk meg. 3—5 darab tíznapos SPF fehér leghorn kakasokat olyan élelemmel etettünk, amely a 19-epi-dianemicint vagy annak nátrium- és/vagy fcáliumsóját .tartalmazta, egyenletesen elkeverve. 24 óra után minden csirkét per os beoltottunk a vizsgálni kívánt Eimeria fajta oocytáival. Egy másik 3—5 darab tíznapos csirkéből álló csoportot olyan táplálékkal etettünk, amely nem tartalmazott 19-epi-dianemicint, ezeket nem fertőztük meg kokcidiummal. Ez volt a normál kontrollcsoport. A kezelés eredményeit E. acervulina esetében 5 nap után, minden más mikroorganizmus esetében 6 nap után értékeltük 'ki. AZ antikokcidiális aktivitás mérésére hasz-5
