192456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
1 192 456 2 Jelen találmány a mikrobiológiai iparra vonatkozik, és tárgya eljárás L-lizin előállítására, amelyet a gyógyszerészeti és élelmiszeriparban, valamint az állattenyésztésben a takarmányok feldúsításához és kiegyensúlyozásához használnak. Ismeretes olyan eljárás az L-lizin mikrobiológiai szintézisére, amely a Brevibacterium fajhoz tartozó termelő törzs aerob feltételek melletti, süllyesztett kultúrájában olyan tápközeget használ, amely szén- és nitrogénforrást, ásványi sókat és növekedésserkentőket tartalmaz. L-lizintermelőként a Brevibacterium fajhoz tartozó baktériumok auxotróf mutánsait, például a Brevibacterium flavum RC—115 vagy sp. E—531 jelű törzseket alkalmazzák, szénforrásként szénhidrátokat, leggyakrabban melaszt, cukrot, valamint ecetsavat, etanolt, szénhidrogént vesznek igénybe. A szükséges nitrogén-, foszfor-, káliummennyiséget szervetlen sók formájában adják a tápközegbe. A szükséges növekedésserkentőt kukoricalekvár vagy fehérjehidrolizátumok formájában juttatják a tápközegbe. A tenyésztés a tápközeg levegőztetése és kevertetése mellett történik. A fermentáció úgy is végezhető, hogy a tápanyagok egy részét a fermentáció során adagolják. 11—13% redukáló anyagot tartalmazó tápközegben történő fermentáláskor 72—90 óra alatt 26—39 g/1 L-lizint állítanak elő, 0,2—0,3 cukorátalakítási tényező mellett. Az L-lizin feldúsulási sebessége 0,2—0,5 g/1 óránként (671 384 sz. szovjet szerzői tanúsítvány, 679 980 sz. szovjet szerzői tanúsítvány). Az L-lizin előállítására vonatkozó ismert eljárásokat komplikált technológia és alacsony L-lizin-hozam jellemzi, amely a hosszabb lag-fá^ zis következménye. Termelési feltételek mellett 12—15 órát tesz ki. A végtermék-hozam bizonyos mértékben emelkedik, ha a fermentálás alatt tápanyagokat adnak a tenyészléhez, habár viszonylag komplikált műszerek szükségesek az anyag hozzáadásához és a koncentráció ellenőrzéséhez. A 78 151 sz. román szabadalmi leírás szerint a Brevibacterium lactofermentum termelő törzset 2,0—3,5-105 Rád dózisú y-sugárzásnak teszik ki, ami mutánsokat eredményez a populációban. A bonyolult szelektálás során nyert legjobb mutáns termelőképessége mintegy 20%-kal haladja meg a kiindulási törzsét. A találmány célja, hogy új technológiai eljárás bevezetésével a gyártási technológia egyszerűsödjön, a végtermék hozama emelkedjék és a tenyésztési folyamat időtartama lerövidüljön. Á cél megvalósítható olyan eljárással, amelyben a Brevibacterium fajhoz tartozó, L-lizint termelő baktériumtörzset süllyesztett kultúrában aerob körülmények között szénforrást, nitrogénforrást, ásványi sókat és növekedésserkentőket tartalmazó tápközegben fermentáljuk és a végterméket izoláljuk. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy az L-lizin-termelőt a tenyésztés előtt 0,5—4,0 kRad/perc dóziserősségű, max. 50 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak vetjük alá. Ha L-lizin-termelőként a Brevibacterium flavum RC—115 jelű törzset alkalmazzuk, az aktivitás emelése érdekében 10—30 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak vetjük alá. A Brevibacterium sp. E—531 törzset célszerűen 0,5—1,0 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak tesszük ki. A különböző Brevibacterium törzsek sugárzási érzékenysége jelentősen különbözik, és nemcsak a törzsi tulajdonságoktól, hanem a sugárzás külső feltételeitől is függ. A sugárzás következtében a sejtek életműködésének folyamatai felgyorsulnak. A tenyésztési folyamat elején a tápanyagok intenzív felhasználása és az L-lizin nagy sebességű feldúsulása figyelhető meg. 48 órás tény észidő alatt az L-lizin-koncentráció 118— 160%-kal magasabb, mint a be nem sugárzott kultúra esetén. Ezenkívül a besugárzott populáció gyorsabban alkalmazkodik, ha az optimális tenyészfeltételek romlanának a fermentálás során, és 200—300%-kal magasabb L-lizin-hozamot termel, mint a be nem sugárzott kultúra. A cukorátalakítási tényező értéke 0,3—0,4-es felső határon marad, jelentősen azonban nem változik, ami arról tanúskodik, hogy a besugárzott sejtek anyagcseréje változatlan marad, tehát a javasolt sugárzás révén elért aktivitásnövekedésnek nem genetikai változások az alapjai. A találmány szerinti eljárás során az alábbiak szerint járunk el. A Brevibacterium törzset hús-pepton-agarra oltjuk, és termosztátban 28—30 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül tenyésztjük. Ezután a ferde agaron levő kultúrát 0,5—4,0 kRad/perc dóziserősségű és max. 50 kRad összdózisú ionizáló sugárzásnak vetjük alá. A sugárzási feltételek a Brevibacterium faj L-lizin-termelőinek meghatározott törzseire vonatkozóan eltérőek, és az adott törzs érzékenységének megfelelően kísérletezzük ki. Sugárzáskor a mikroorganizmus sejtjeinek anyagcseréje felgyorsul. A sejtek növekedési és fejlődési sebessége, a tápanyagok asszimilációja és az L-lizin-bioszintézis kétszeresére növekedik. Ha mikroorganizmusokat 0,5 kRad alatti dózissal besugározzuk, akkor ilyen hatást nem érhetünk el. Nem változik a sejtek anyagcseréje. 50 kRad összdózis feletti besugárzáskor a sejtek növekedése csökken, a sejtosztódási folyamatban fellépő anomália miatt, ami a DNS és RNS károsodásából következik. Besugárzás után az agaron levő kultúrát az inokulum tenyésztéséhez használjuk. Ehhez olyan tápközeget használunk, amely szén-, nitrogénforrást, ásványi sókat és növekedésserkentőket tartalmaz és például a következő összetételű (g per 1 litencsapvíz): 50%-os cukortartalmú melasz 200,0 (ami 10 + 0,5% redukálóanyagtartalomnak felel meg) 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
