192409. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált fenilalkil-(piperazinil vagy homo piperazinil)-propil-karbamaidok vagy tiokarbamaidok előállítására
1 2 192.409 245 246 °C, c) 1- 3-[4-(4-eiano-bcnzi!)-pipcr.tzin-l-iI]-propil -3- -[4-(etoxi-karlx>niI)-fenil]-karbamid-dihidrok1orid, op:241-245°C. f) 1- 3-|4-(4-metoxi-bciizil)-piperazin-1 -ilj-propil - -3-f4-(e(oxi-karl)oiiil)-i'enil]-karbauiid-ilihi<lrokiorid, op.: 215 -218 °C. g) 1- 3-{4-(4-/metil-tio/-benzil)-piperazin-l -il]-propil -3-[4-(ctoxi-karbonil)-fenill-karbamid-dihidroklorid-nionohídrát, op.: 200-222 C. g) 1 - 3-[4-(4-ivietiI-ben/iI)-piperazin-l-iI]-propil -3- -[4Tctoxj-karboniI)-fenil]-karbainid-dihidroklorid-monohidrát, op.: 226-229 C, i) l - 3-{4-(4-/trifluor-metiI/-benzjl)-piperazin-l -il]•propi! -3-f4 Ictoxi-karbonilj-fenill-karbamid-dihidroklorid-inonolndrat, op.:240-243 C. j) 1- 3-[4-(4-/ctoxi-karboni]/-benziJ)-piperazin-l-il]-propil -3-[4-(etoxi-karbonil)-fenil]-karbamid-dihidroklorid-monohidrdt, op.: 235-237 °C. k) 1 - 2-f4-(4-k]ór-benzj])-piperazin-l -il]-etil -3-{4- -ciano-fcniO-karbamid-dihidroklorid, op.: 217—219 °C, l) 1 - 4-[4{4-klór-benzíl)-piperazin-l -il]-butil -3-[4- -(etoxi-karbonil)-fenilj-karbamid-dihidroklorid-hemilúdrát,op.: 227-228 C. 38. példa Az 1 általános képletű vegyületeknek az emberi leukocitákból (bazofilckből) és patkány peritonealis hízósejtekből való hisztamin felszabadulásra gyakorolt in vivo gátló hatását a következő biológiai vizsgálatokkal mutatjuk be. A) Eljárás humán leukodta (bazofil) hisztamin leadására gyakorolt in vitro gátló hatás meghatározására 1. A leukociták elkülönítése: L. Lichtenstein és A. Osler [J. Exp. Med. 120,507 (1964)] eljárásának módosított változatát alkalmaztuk. 80-100 ml.heparinnal kezelt emberi vért 20 ml, 0,2%-os, 0,6 g dextrózt és 02 g dextránt tartalmazó sóoldattal propilén centrifugacsőben összekevertünk. Az elegyet 60-90 percig környezeti hőmérsékleten tartottuk, hogy a lemezkében és leukocitában gazdag felső rétegből az eritrodták elkülönüljenek. A felső réteget eltávolítóitok és 8 percig 110 x g-vel hidegen centrifugáltuk. A Ieukocita lemezkéket trisz-pufferrel kétszer mostuk, és végül 150-180 ml trisz-ACM pufferben szuszpendáltuk, így 1—2 x 166 sajt/ml-es szuszpenziót kaptunk. 2. A reakcióelegy: A reakdót 12x75 mm-es műanyag csövekben végeztük, össztérfogat 1,25 ml. A reakdóközeg 0,05 ml nyúl antihumán IgE-ből (az antigén). 02 ml. a vizsgálandó vegyületet 10-1000-yM koncentrációban tartalmazó vizes oldatból és I, 0 ml Ieukocita szuszpenzióból állt. A reakdóelegyet 37 °C-on vízfürdőben rázás közben inkubáltuk 60 percig. A reakció befejeződése után a csöveket centrifugáltuk és a fclülűszót összegyűjtöttük. A fehérjét 02 ml K'3-os perklórsawal való kicsapással távolított uk el belőle. 3. Iliszlanán-meghatarozás. A hisztamin leadást W. Siriganian és W. Hook automatizált fluorometriás módszerével mértük (Manual of Clinical Immunology. 102. fejezet, 2. kiadás. Szerkesztő: R. Rose és II. Friedman, Kiadó: American Sodety for Microbio-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 logy, Washington D.C. 1980). A százalékos gátlást a következő képlet alapján számoltuk: (Kontroll üres-(vizsgálati minta üres) (kontroll -üres) x 100 A hisztamin leadás 50%-os gátlását okozó (IC50) koncentrációt interpolálással állapítottuk meg a százalékos gátlást a hatóanyag koncentráció logaritmusának függvényében ábrázoló grafikonból. B) Eljárás patkány peritoneális hízósejtek hisztamin leadására gyakorolt gátló hatás meghatározására 1. A peritoneális hízósejtek összegyűjtése: Miután a patkányokat éterrel megöltük, 20 egység/ml heparint tartalmazó 20 ml MEN-oldatot (Minimum Essential Medium) injektáltunk a hashártyába. A hasat egy percig masszíroztuk és a mosófolyadékot összegyűjtöttük. A peritoneális sejteket 1800-as fordulatszámmal 8 perdg hidegen centrifugáltuk. Trisz A pufferrel kétszer mostuk, majd trisz-ACM pufferben szuszpendáltuk, a koncentráció 2-4x10^ sejt/ml. 2. A reakcióelegy : A reakciót 12x75 mm es műanyag csövekben végeztük, össztérfogat 1,25 ml. A reakcióelegy 0,05 ml (10 100 pg) bárányból származó patkányelleni IgE-ből vagy tojásfehérjéből, 0,2 ml, a vizsgálandó vegyületet 10 1000 pM koncentrációban tartalmazó vizes oldatból,0,5 ml foszfatidil-szerinből (csövenként 20 60 pg), és 0,5 ml sejtszuszpenzióból állt. A rcakcióelegyet 37 °C-on, vízfürdőben, rázás közben inkubáltuk 60 percig. A reakció befejeződése után a csöveket centrifugáltuk, és a felülúszót összegyűjtöttük. A fehérjét 02 ml 8%-os perklórsawal való kicsapással távolítottuk el belőle. 3. Hisztamin-meghatározás: A hisztamin leadást Siriganian automatizált fluorometriás módszerével határoztuk meg (Id. fentebb). A hisztamin leadás 50%-os gátlását okozó (IC50) koncentrációt A) részben leírtak szerint számítottuk. Az I általános képletű vegyületeknek a humán leukodtákből való hisztamin felszabadulás gátlására vonatkozó, A) módszer szerinti vizsgálatának eredményei az A) Táblázatban láthatók. A) Táblázat Vizsgált vegyület Gátlás (A példa száma) ICS0 (MM) 1. 50 2. 300 3. 50 4. 8 5. 16 6. 50 7. 240 8. 400 9. 78 10. 30 11. 37 12. 80 13. 190 14. <1000 15. 20 16. 30 17. 1 9
