192401. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid-antibiotikumok előállítására
1 2 A PTL-448 A,B,C és 1) antibiotikumok feltételezeit szerkezet a (11) általános képletnek felel meg: PTL448-Rt Ra A-COCH-, mikarozil (III) általános képletű csoport B H mikarozil C-COCH3 H D H H A fenti (II) általános képletben nem mutatjuk a téiszerkezetet, de valószínű, hogy a molekula különböző alkotó-elemeinek térszerkezete megegyezik a protilonolidéval (középponti lakton), a forózaminéval (balra-forgató lakton) és a mikaminozéval (jobbraforgató cukor). A protilonolid-forózamin kapcsolat térszerkezete valószínűleg 9-a-Q-ß- forózaminil. A szakember azonnal rájön, hogy a (II) általános képletű vegyületben található amino-funkció azt jelenti, hogy a szabad bázisok képesek sav-addiciós sókat létrehozni. Ezek a sók mindaddig amíg a melegvérű állatok kemoterápiájában való alkalmazáshoz megfelelő alacsony toxicitással rendelkeznek, mint gyógyászatilag elfogadható sók, a találmány szerinti hasznos antibiotikumok. Az ilyen tipusú sók közé tartoznak azok, melyek standard reakcióban keletkeznek vagy szerves vagy szervetlen savakkal, például kénsav, sósav, foszforsav, ecetsav, borostyánkősav, citromsav, tejsav, maleinsav, fumársav, palmitinsav, kólsav, pamoesav, nyálkasav, D-glutaminsav, d-kámforsav, glutársav, glikolsav, ftálsav, borkó'sav, hangyasav, laurínsav, sztearinsav, szalicilsav, metánszulfonsav, benzolszulfonsav, szorbinsav, pikrinsav, benzoesav és fahéjsav. A PTL-448 makrolid antibiotikumokat úgy állíthatjuk elő, hogy a Streptomyces ambofaciens törzset a fenti makrolid vegyületek jelenlétében tenyésztjük. A tenyészléhez adott makrolid-vegyületeket használhatjuk külön-külön, vagy kombinációban. Előnyösen 10-500 /ag/ml koncentrációban vannak jelen a tény észlében. A termék mennyiségét enzim-inhibitorral például ceruleninnel megnövelhetjük (lásd Methods in Enzymology, 72, 520 /1981 /). Az enzim-inhibitor, például a cerulenin előnyös koncentrációja a tenyészlében 10—200 jug/ml. A jelen találmány szerinti tenyésztő táptalaj lehet minden olyan szokásos, folyékony vagy szilárd formájú, szintetikus és természetes táptalaj, melyen a használt törzs nő, és a PTL448 jelű anyag keletkezik protilonolidból és a rokon vegyöletekből. Azok a megfelelő táptalajok, melyeket az Actinomycese,úgymint Streptomycese alkalmazásával antibiotikumok fermentációs úton történő előállítására használnak. Szénforrásra példaként megemlíthetjük a glükózt, maltózt, szacharózt, keményítőt, dextrint, glicerint, állati zsiradékokat és növényi olajokat. A nitrogén-forrásra példaként megemlíthetjük a különböző nitrogén-tartalmú anyagokat, úgymint az élesztő-kivonatot, hús-kivonatot, peptont, szójalisztet, száraz élesztőt, ammóniát és karbamidot. Ezeken felül szükség esetén szervetlen sókat, úgymint foszfátokat, fémsókat, például a mangán, magnézium-kálium, nátrium, vas,kobalt stb. sóit használhatjuk. A mikroorganizmusokat aerob körülmények között tenyésztjük, úgymint rázott tenyészetet vagy kevertetett-levegőztetett tenyészetet használva. A tenyésztés hőmérséklete általában 20 és 40 °C között lehet. A PTL-448 származék megtermelt mennyiségét megnövelhetjük úgy is, hogy aPLT-448 molekulában levő cukor-egységeket külön állítjuk elő és a tenyészléhez adjuk. Ezeket a cukrokat a spiramicin és tolizin kémiai lebontásával állítjuk elő, A tenyésztés ideje 1—10 nap, ez alatt az idő alatt jönnek létre a PTL-448 származékok és összegyűlnek a micéliumon belül és kívül. A tenyésztés befejezése után a PTL-448 származékokat a bázikus zsiroldékony anyagoknál általánosan használt módszerekkel nyerjük ki a tenyészléből. Például a micéljumot elválasztjuk a szűrlettől, majd a szűrletből szerves oldószerrel, például etil-acetáttal, benzollal és hasonlóval extraháljuk a PTL448 származékot, majd az oldatot besűrítjük. Hasonlóképpen, vizes acetonnal vagy vizes metanollal vagy hasonlóval extraháljuk a PTL-448 származékot a micéliumból, és az oldatot besűrítjük. A PTL448 származékot ezután jól ismert tisztítási eljárásokkal, például szilikagél vagy alumínium-oxid oszlopkromatográfiával, vékonyréteg kromatográfiával és hasonlókkal tisztíthatjuk. A fermentáció közvetlen termékeit, a PTL448-A és PTL448-B jelű anyagokat savas hidrolízissel átalakíthatjuk demikarozil analógjaikká, azaz PTL448-C és PTL-448-D jelű vegyületekké. A PTL448-C és -D vegyületeket például úgy állíthatjuk elő, hogy PTL- 448-A és -B egyikét vagy mindkettőt szerves oldószerben oldjuk, majd savas pH-n kevertetve kapjuk a PTL448-C és -D származékokat, melyek kinyerhetők a reakció-elegyből. A PTL448-C és -D származékokat természetesen, közvetlenül is előállíthatjuk a tenyésztés során, a fermentációs körülmények változtatásával. így ha olyan mikroorganizmust használunk, melyből hiányzik a mikaróz-szintetizáló képesség vagy a mikaróz makrolid típusú aglikonokhoz való kötésének képessége, a PTL448-C és-D származékok közvetlen keletkezését figyelhetjük meg. A savas hidrolízis végrehajtására használt sav lehet erős ásványi sav, például sósav vagy kénsav, vagy szerves sav, például hangyasav. A hidrolízis során a pH értékét előnyösen 1 és 3 között tartjuk. A hidrolízist végrehajthatjuka tenyészlében, vagy tenyészléből izolált PTL448-A és -B származékokon. A hidrolízist mindkét esetben 10 és 80 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A hidrolízis végrehajtásához szükséges idő normális körülmények között 10 perc és 10 óra között változik, de figyelembe kell venni a PTL448 származékok stabilitását. A találmány illusztrálására a következő, nem-korlátozó példákat mutatjuk be. 1. példa Oltóanyagként Streptomyces amgovaciens ATCC 15 154 (NRRL 2420) törzset használunk. Az említett törzset 500 ml-es Sakaguchi lombikban levő 100 ml inukulum-táptalajba oltjuk (glükóz 2.0%, hús kivonat 0,5%, pepton 0.5%, száraz élesztő 0.3%, nátrium-klorid 0.5%, kalcium-karbonát 0,3%,pH 7.0), majd 48 órán át 27 °C-on rázatjuk. Az így nyert oltóanyag 1%-nyi mennyiségével oltunk 500 ml-es Sakaguchi lombikban levő 100 ml fermentációs táptalajt (10% glükóz, 1.0% száraz élesztő, 0.5% nátrium-klorid, 1.9% kálcium-klorid, 0.1% nátrium-nitrát pH 7.5), majd 27 °C-on folytatjuk a tenyésztést. A tenyésztés 192.401 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
