192388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nurzeotricin előállításáraa, valamint só alakjában vagy adszorbeált állapotban történő kinyerésére
1 2 mentálist 30—80%, előnyösen 40—60% parciális oxigénnyomás (pO^) mellett végezzük. (A parciális oxigénnyomás relatív érték, a levegőztetett, kevert tápközegben inokulálás előtt oxigén-érzékelővel méljük a telítettségi értéket /= 100%/. Inokulálás után a növekvő mikroorganizmus az oldott oxigén egy részét elfogyasztja, így az érzékelő kisebb értéket mér, amelyet a telítettségi értékhez viszonyítva százalékban fejezünk ki. A módszer leírása: A Moser, Bioprozesstechnik, Springer-Verlag Wien New York 1981). Meglepő módon azt találtuk, hogy — a pH-értéket megfelelő koncentrációjú ammónium-hidroxid-oldat adagolásával (abban a tartományban, amelyben mint fiziológiai szabályozó hatékony) beállítva - megfelelő névérték intervallum megválasztása esetén az ammónium-hjdroxid adagolásának időbeli lefolyása a fiziológiailag hatásos foszfát fogyasztásának időbeli alakulását ábrázolja. Az ábrázolás léptéke a pH-érték1 névértékének alsó határától függ. A pH alakulása a fermentálás első óráiban és ezzel az ammónium-hidroxíd adagolásának kezdete az indulási tápanyag pufferolásától függ. Az említett összefüggés kellő érzékenységű folyamatos bemeneti jelként hasznosítható a közvetlen és/vagy közvetett foszfát-adagolás szabályozásában és így a fermentációs kultúra metabolikus aktivitásának szabályozásában. A foszfátok közvetlen adagolása foszfáttartalmú anyagok külső tárolóból végzett adagolásaként valósul meg, míg közvetett adagolás esetén a foszfát komplex szubsztrátumok enzimes vagy hidrolitikus bontásából származik. Azt találtuk, hogy a foszfátok közvetlen és közvetett adagolása közötti átmeneteket az ammóníum-hidroxíd adagolásának görbéje szignifikáns emelkedéssel, illetve lejtésével jelzi. A változás mértékét a foszfátok beálló utánpótlása határozza meg. Azt találtuk, hogy az ammónium-hidroxid aktuálisan adagol mennyisége szabályozó jelként hasznosít-' ható szénforrások, további nitrogén-források és egyéb effektor hatású anyagok adagolásában, és — az adott fermentor oxigénátmeneti tényezőjének figyelembevételével - a foszfát közvetlen adagolását kedvező mennyiségű termék képződése irányában lehet változtatni. Így a készüléktől függő oxigénbeviteli körülmények között, meghatározott mennyiségű levegőztetés mellett, magas végső termékszint, a szubsztrátum kívánt fermentációs időn belüli hatékony hasznosítása és a biomassza képződésének feldolgozható mennyiségre való korlátozása valósítható meg. Azt találtuk továbbá, hogy a reakcióhő és/vagy a távozó gázelegy O^/CC^-aránya az anyagcsere aktivitásának időbeli lefolyását követi. Ezért a mindenkori reakcióhő, valamint az említett összetétel szintén vezérlő jelként hasznosítható foszfátok és egyéb anyagok adagolásában. A találmány szerintinek megfelelő nurzeotridntermelő Streptomyces fajták, előnyösen a Streptomyces noursei fajták között azok alkalmazhatók, amelyek az alábbi követelményeknek tesznek eleget:- a nurzeotridn képződése érzékeny legyen a termelő fermentálás tápanyagában lévő oldható foszfát maps koncentrációjára,- a mikroorganizmusnak komplex, foszfáttartalmú szén- és nitrogénforrások hasznosítására képesnek kell lennie,- a polimer szénforrások feltárásához amilolitikus aktivitással rendelkezzék. A leírt eljárás konkrét megvalósítási formája attól függ, hogy az alkalmazott törzs a fenti három követelménynek milyen mértékben felel meg. A termelő törzs foszfátokkal szemben nagy érzékenysége esetén kellő amtibiotikumtermeiést csak akkor tudunk elérni, ha a tápközegben az oldható foszfátként kötött foszfor kiindulási koncentrációját a fent leírt intézkedések (bázikus kémhatás mellett végzett hősterilizálás és/vagy a foszfátokat kicsapó anyagok adagolása) segítségével 10 ing/1 alatt tartjuk. A tápközegben elegendő mennyiségben jelen lévő komplex foszfáttartalmú szubsztráíumokat jól feltáró örzs esetén fermentálás alatt a foszfát adagolását íkár zéró értékre csökkenthetjük. Ha a nurzeotricintermelő Streptomyces törzs nagyobb foszfát-koncentrációk ellen rezisztens, a foszfátokat kicsapó anyagoknak a termelő tenyészetbe történő adagolását zéró értékre csökkenthetjük. Kísérleteink szerint az ilyen Streptomyces törzsek egyidejűleg erős amilolitikus aktivitással is rendelkeznek. A tenyészlé feldolgozása, a hatóanyag kinyerése céljából végzett kísérletek során meglepő módon azt találtuk, hogy a nurzeotridn micélium-tartalmú adszorbeátum alakjában különíthető el. A fermentálás megszakítása után a tenyészlő pH-értékét híg kénsavoldat adagolásával enyhén savas kémhatásra, előnyösen 6,0 és 6,2 közötti értékre állítjuk be. Ezt követően valamilyen fiziológiailag elfogadható adszorbens, például natrifikált bentonit enyhén savas, vizes szuszpenzióját keverjük a ten} ősziéhez, ügyelve arra, hogy a j)H-érték 5,5 és 6,5 között maradjon. A leülepedő, - nurzeötridntartalmú szilárd anyagot szűréssel vagy centrifugálással választjuk el, majd áramló meleg levegőben legfeljebb 70 6C-os termékhőfok mellett szárítjuk. Az így kapott micéliumtartalmú adszorbeátum nurzeotridn-bázisként számítva 1-10%, többnyire 4-7% hatóanyagot tartalmaz. Meglepő módon azt is találtuk, hogy a nurzeotridn bizonyos sói 90-95%-os vizes metanolban nehezen oldódnak, ezért az alábbiakban részletezett módon elkülöníthetők és tisztíthatok. A nurzeotridn gyengén savas ioncserélővel képzett adszorbeátumát olyan híg, többértékű savval eluáljuk, amely a nurzeotricinnel metanolban oldhatatlan sókat képez. Az eluátumban kísérő anyagként jelen lévő többértékű szervetlen kationokat vízben oldhatatlan sóik alakjában kicsapjuk. Az egyértékű szervetlen kationok eltávolítása céljából az eluátumot szulfonsav-tipusú, H-formájú, erősen térhálósított kationcserélővei kezeljük és a felszabaduló savakat OH-formájú anioncserélővei semlegesítjük. Az eluátumot vákuumban betöményítjük, a szennyeződéseket aktív szénen adszorbeáltatjuk, és a nurzeotridn tiszta sóit metanollal végzett kicsapással vagy kímélő szárítással kinyerjük. A nurzeotricin szulfátja amorf, fehér, vízben jól oldódó, metanolban és a legtöbb szerves oldószerben nehezen oldódó port képez. A termék elemi összetétele (C = 32,46, 32,31, H = 6,65, 6,22, N = 15,73, 16,00, S = 7,74,7,60) messzemenően megfelel a streptitridn-D-szulfát (C^iH1rSN19Oin.2,5 K->H04.H9Ó) és a streptotricín-F-szulfát (C^H^NoOo-l ,5 t^SO,* .H2O) 1:1 arányú keveréke összetételiek, A nurzeotricin oxalátja, amorf, fehér, vízben jól oldódó, alkoholban és egyéb szerves oldószerekben 192.388 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
