192165. lajstromszámú szabadalom • Eljárás BBM-1644 jelű antibiotikum előállítására
1 192165 2 szét 5 ml-ével indítjuk meg a fermentációt, 2,5% mannit, 0,5% glükóz, 1% szójaliszt, 0,5% pepton, 1 % húskivonat, 0,3% CaC03 és 0,2% NaCl összetételű 100 ml tenyészlevet tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban. A fermentálást 28 °C-on hajtjuk végre forgó rázógépen (250 ford/min). Az antibiotikum termelést papírkorong-agar diffúziós próbával követjük, kísérleti organizmusként Bacillus subtilis M45-öt (rec- mutáns) használva. A tenyészlé antibiotikus aktivitása a fermentáció előrehaladásával fokozatosan növekszik és 6 ~ 7 nap után mintegy 300 mcg/ml-t ér el. 2. példa Az 1. példában leírt fermentációkból származó fermentlevet (18 liter) centrifugával (Kokusan N° 4A) micéliumlepényre és felülúszó folyadékra választjuk szét. A szűrt levet 40 °C alatti hőmérsékleten eredeti térogatának 1/10-ére koncentráljuk és a koncentrált oldatot cellofán csőben (Union Carbide) csapvízzel szemben dializáljuk. A csőben visszatartott oldatot körülbelül 1,5 literre koncentráljuk és ezt az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából centrifugáljuk (8000xg). A tiszta felülúszót ammónium-szulfáttal telítjük és 5 °C-on 5 óráig állni hagyjuk. A képződött csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, vízben (300 ml) oldjuk és csapvízzel szemben dializálva sómentesítjük. A dializált oldat (700 ml) BBM-1644-ből álló 22 g nyers szilárd anyagot tartalmaz, amint ez az oldat egy részének liofilezése útján megállapítható. Az oldat többi részét a bomlás elkerülése végett koncentrálás nélkül tisztítjuk. Az antibiotikum-oldatot DEAE-cellulóz (Cl-, 400 ml) oszlopon bocsátjuk át és az oszlopot vízzel (1 liter) mossuk, majd 0,3M NaCl-ot tartalmazó 1/15M foszfát-pufferrel (pH 7,0) kifejlesztjük. Az aktív frakciókat egyesítjük (300 ml), 18 óráig csapvízzel szemben dializáljuk és 1/15M foszfát-pufferrel (pH 7,5) kiegyensúlyozott DEAE- cellulóz oszlopon (400 ml) kromatografáljuk. Az oszlopot növekvő mennyiségű NaCl-ot (0 ~ 0,2M) tartalmazó fenti pufferrel fejlesztjük ki. Az aktív eluátumot dialízissel sómentesítjük és DEAESephadex A-50 oszlopra (17 ml) visszük fel. Az oszlopot gradiens koncentrációjú NaCl-ot (0 ~ 0,3M) tartalmazó 1/15M foszfát-pufferrel fejlesztjük ki. A B. subtilis M45 próbában aktívnak talált frakciókat egyesítjük és folyóvízzel szemben 18 óráig dializáljuk. A sómentesített oldatot DEAE-Sephadex A-50 oszlopon (18 ml) kromatografáljuk, eluensként 1/15M foszfát-puffer (pH 7,0) - NaCl (0 ~ 0,3M) rendszert használva. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, 10 ml-re koncentráljuk és sómentesítés céljából Sephadex G-50 oszlopra visszük fel. Az oszlopot ionmentesített vízzel euláljuk és az aktív frakciókat liofilezve 120 mg fehér port kapunk. Az így kapott BBM-1644 mintát poliakrilamidgél-elektroforézissel homogénnek találtuk. A termék ÍR- és UV- spektrumát az 1. és 2. ábra mutatja. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás a BBM-1644 antibiotikum előállítására, melynek jellemzői : 5 (a) hatásosan gátolja Gram-pozitív és saválló baktériumok növekedését; (b) hatásosan gátolja egérnél a P388 leukémia fejlődését ; (c) lizogén baktériumokban profág-indukcióra 10 képes; (d) oldódik vízben, de gyakorlatilag oldhatatlan metanolban, etanolban, acetonban, etil-acetátban és «-hexánban; (e) az 1. ábrán látható infravörös abszorpciós 15 spektrumot mutatja (KBr-pasztillában); (0 vízben, 0,01 n sósavoldatban és 0,01 n nátriumhidroxid-oldatban a 2. ábrán látható ultraibolya abszorpciós spektrumot mutatja; (g) fajlagos optikai forgatóképessége 20 0$ = - 75,6 ° 0,25%-os vizes oldatban; (h) nincs éles olvadáspontja, de 240 °C felett fokozatosan elbomlik; (i) 4500 V-on 8,6 pH-jú 0,05 M barbitál-pufferrel 1 óráig folytatott papír-elektroforézis folyamán kö-25 rülbelül 8,7 cm-t mozdul ez az anód felé; (j) elemi analízise: 46,60% szén; 6,45% hidrogén; 13,34% nitrogén; 0,20% kén és - a különbségből - 33,41% oxigén; ,n (k) nagy molekulasúlyú pepiid, melynek molekuu lasúlya körülbelül 2200; (l) elszínteleníti a kálium-permanganát-oldatot és pozitiv Folin-Lowry, xantoprotein, biuret és ninhidrin reakciót és negatív antron- és Sakaguchireakciót ad; és (m) hidrolízis után a következő relatív aminosavösszetételt mutatja, ha a leucin-tartalmat önkényesen 1,0-nak vesszük: alanin - 8,8; aszparaginsav - 6,0; cisztín j - 1,0; glutaminsav - 5,7; glicin - 8,7; izoleucin - 2,3; leucin - 1,0; fenil-alanin - 1,4; prolin - 4,1 ; szerin - 1,6 ; treonin - 7,2 ; tirozin - 0,6 és valin - 11,1; azzal jellemezve, hogy az Actinomadura sp. ATCC39 144 törzsét vagy annak BBM-1644 termelő mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartal- 45 mazó vizes tápközegben szubmerz aerob körülmények között tenyésztjük és a BBM-1644-et kívánt esetben kivonjuk a fermentléből. 2. Eljárás baktériumellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy az 1. 50 igénypont szerinti előállított BBM-1644-et gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy higítóanyagokkal keverve parenterális dózisformává dolgozzuk fel. 3. Eljárás daganatgátló hatású gyógyszerkészít- 55 mények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított BBM-1644-et gyógyászatiig elfogadható hordozó- vagy hígítóanyagokkal keverve parenterális dózisformává dolgozzuk fel. 60 2 oldal rajz Kiadja az Országos Találmányi Hivatal A kiadásért felel: Himcr Zoltán osztályvezető Szedte a Nyomdaipari Fényszedő Üzem (878402/09) 88-2314 — Dabasi Nyomda, Budapest — Dabas Felelős veze'ö: Bálim Csaba igazgató
