192165. lajstromszámú szabadalom • Eljárás BBM-1644 jelű antibiotikum előállítására
1 192165 2 3. táblázat (folytatás) A H710-49 törzs szénforrás-hasznosítása* D-Fruktóz + D-Mannóz — L( - )-Szorbóz — Szacharóz — Laktóz-Cellobióz + Melibióz-T rehalóz + RafFinóz — D( + )-Melecitóz-Oldható keményítő + Cellulóz — Dulcit-Inozit — D-Mannit + D-Szorbit-Szalicin* Megfigyelés 3 hetes 28 °C-on való inkubálás után. Alaptáptalaj : Pridham-Gottlieb szervetlen táptalaj A H710-49 tisztított sejtfala mezo-diaminopimelinsavat tartalmaz, de nem tartalmaz glicint. A teljes sejt-hidrolizátumban maduróz (3-O-metil- D-galaktóz), glükóz, ribóz és kevés mannóz mutatható ki. A H710-49 törzs sejtfalösszetétele és a teljes sejt cukor-komponensei arra utalnak, hogy a törzs sejtfala IIIB típusú. A H710-49 törzs fent leírt jellemzői az Actinomadura nemzetség jellemzőihez hasonlítanak. Goodfellow és munkatársainak az Actinomadura és rokon Actinomycetaceae családba tartozó fajokra vonatkozó numerikus rendszertana szerint [J. Gén. Microbiol. 112, 95-111 (1979)] a legtöbb talajból származó Actinomadura faj a leírt 14 csoport közül a 7. számú csoportba sorolható be. A H710-49 törzs a 7. csoport fajaihoz áll a legközelebb. Nonomura és Ohara [J. Ferment, Technoi. 49, 904-912 (1971)] az Actinomadura nemzetség 5 szaprofita faját írta le és Nonomura [J. Ferment. Technoi. 52, 71-77 (1974)3 és Preobrazhenskaya és munkatársai [Actinomycètes and Related Organisms 12, 30-38 (1977)] az Actinomadura fajok azonosítását és osztályozását írják le. Az irodalomban leírt ismert Actinomadura fajokkal való összehasonlítás alapján a H710-49 törzset egy új Actinomadura fajhoz tartozónak tartjuk, amely hasonló a Preobrazhenskaya és munkatársai fent idézett közleményében és a „Japanese Kokai” 55/94 391-ben leírt A. roseola, A. salmonea, A. vinacea vagy A. corallina fajokhoz. Bár a BBM-1644 termelését részletesen az Actinomadura sp. H710-49 törzsre (ATCC 39 144) írtuk le, megjegyzendő, hogy a találmány nem korlátozódik ezen mikroorganizmus vagy az itt részletesen leírt tenyésztési jellemzők által meghatározott mikroorganizmusok felhasználására. Kifejezett szándékunk szerint a találmány magában foglalja a H710-49 törzs és annak valamennyi természetes és mesterséges BBM-1644-termelő variánsa és mutánsa felhasználásával történő BBM-1644 előállítást. Antibiotikum-termelés A találmány szerinti BBM-1644 antibiotikumot úgy állítjuk elő, hogy az ATCC 39 144 vagy mutánsa azonosító jellemzőivel rendelkező Actinomadura sp. törzset szokványos vizes tápközegben tenyésztjük. A tenyésztéshez használt tápközeg az Actinomycetaceae ismert tápanyag-forrásait tartalmazza, azaz asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, szervetlen sókat és más ismert növekedési faktorokat. Nagy mennyiségű antibiotikum termelését előnyösen szubmerz aerob körülmények között hajtjuk végre, bár korlátozott mennyiségek előállításához felszíni tenyészetek és palackok is használhatók. A találmányhoz más, Actinomyceteaceae családba tartozó törzsek tenyésztéséhez használt általános eljárások alkalmazhatók. A táptalajnak alkalmas asszimilálható szénforrást kell tartalmaznia, így glicerint, L( + )-arabinózt, D-xilózt, D-ribózt, D-glükózt, D-fruktózt, oldható keményítőt, D-mannitot vagy cellobiózt. Nitrogénforrásként ammónium-klorid, ammónium-szulfát, karbamid, ammónium-nitrát, nátriumnitrát és hasonlók használhatók vagy egyedül, vagy szerves nitrogénforrásokkal, mint peptonnal, húskivonattal, élesztőkivonattal, kukoricalekvárral, szójababporral, gyapotmagliszttel és hasonlókkal együtt. Szükség esetén szervetlen tápsók is alkalmazhatók nátrium-, kálium-, kalcium-, ammonium-, foszfát-, szulfát-, klorid-, bromid-, karbonát-, cink-, magnézium-, mangán-, kobalt-, vasforrásként. A BBM-1644 antibiotikum termelése az organizmus kielégítő növekedését elősegítő bármely hőmérsékleten végrehajtható, például 20-37 °C-on, és általában mintegy 27-32 °C hőmérsékleten alkalmazunk. Optimális termelést rázatott lombikokban kapunk 6-7 napi inkubálás után. Ha a fermentálást kádakban kell végrehajtani, valamely tápfolyadékban célszerűen vegetativ inokulumot állítunk elő oly módon, hogy a tenyészfolyadékot beoltjuk az organizmus ferde agaron nőtt tenyészetével vagy liofilezett tenyészetével. Az így kapott aktív inokulumot fertőzésmentes körülmények között átvisszük a fermentáló tartály tápközegébe. Az antibiotikum képződést papírkorong-agardiffúziós próbával követjük, teszt-organizmusként Bacillus subtilis M45-öt használva [rec mutáns; Mutation Res. 16, 165-174(1972)]. Izolálás és tisztítás Amikor a fermentáció befejeződött és szűréssel vagy centrifugálással a szilárd részt eltávolítottuk, a BBM-1644 főként a fermentlé folyékony részében van jelen. így az összegyűjtött fermentlé centrifugálással micélium-üledékre és tápfolyadék-felülúszóra választható szét. A szűrletet azután koncentráljuk és csapvizzel szemben félig-áteresztő hártya, mint cellofáncső segítségével dializáljuk a hártyán átmenő szennyezések eltávolítása céljából. A cső belsejében visszatartott, BBM-1644-et tartalmazó oldatot (az oldhatatlan anyagok eltávolítása után) azután kisózó reagenssel, mint ammónium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 30 65 4
