192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 5. táblázat A41030 faktorok UV spektrofotometriája Faktor Savas vagy semleges max nm (e) Lúgos max nm (e) A 178(11,100) ■298(17,200) B 278 ( 9,600) 298(16,800) C 278 ( 8,400) 298 (14,000) D 278(10,600) 298(19,900) E 278 ( 8,500) 298(15,500) F 278 ( 9,300) 298 (14,500) G 278(15,000) 298(18,000) Az A41030 antibiotikum A faktor oldódik alkohol/víz elegyekben, dimetil-szulfoxidban, dimetil-formarnidban, 'bmetil-szulfoxid/víz elegyben, dimetil-formamid/vlz elegyben, híg vizes savban és híg vizes lúgban. A megfigyelt fizikai-kémiai adatok alapján az A41030 A faktor az (I) szerkezeti képlettel ábrázolható. Biológiai próbával és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás analízissel azt találtuk, hogy az A faktor az A41040.4 tenyészet által termelt antibiotikus faktorok mintegy 94-96 tömeg%-át, míg a B, C, D, E, F és G faktor a képződött faktorok fennmaradó mintegy 4—6 tömeg%-át teszi ki. 4. példa A41030 B faktor izolálása Az A41030 komplex 1,0 g-ját feloldjuk 35 ml víz-acetonítril/NaCl (85:15:2 g per liter) oldószerelegyben és az oldatot 4,7x 45 cm-es „Michel-Miller” nagy teljesítményű alacsony nyomású folyadékkromatográfiás (HPLPLC) üvegoszlopra (Ace Glass, Inc., Vineland, NJ 08360) visszük fel, melyet laboratóriumunkban töltöttünk meg 25—40 mikronos LiChroprep RP-18-cal [szilikagéihez kémiailag kötött szénhidrogénfázis (Ci*), MC/B Manufacturing Chemists, Inc., Cincinatti, OH], „FMI” szelepnélküli dugattyús szivattyút (fluid Metering Inc., Oyster Bay, NY 11771) alkalmazva a minta feloldásához használt oldószerrel azonos eluens 21 mi/min sebességgel halad át az oszlopon (690 kPa), és 21 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az eluátumot „ISCO Model UA—5” UV detektorral ellenőrizzük 280 nm hullámhosszon. Az 1 — 183. frakciót elöntjük. Az A faktorban dús 184— —245. frakciót egyesítjük és csökkentett nyomás alatt 25 ml térfogatra bepároljuk. Hét hasonló tisztítási műveletből származó koncentrátumot egyesítünk, vízzel 1,4 literre hígítjuk és 8—10 ml/min sebességgel 100 ml Diaion HP—20 gyantaoszlopon bocsátjuk át, melyet előzőleg vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot vízzel (600 ml) addig mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Víz/metanol (1:1) eleggyel eluálunk 8-10 ml/min sebességgel, 300 ml-es frakciókat gyűjtve, A frakciókat B. subtilis elleni aktivitás szempontjából elemezzük. Az 1—5. frakciót egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és liofilizáljuk. 523 mg nyers B faktort kapunk. A két egyesített nyers B faktor preparátum 550 mg-ját 10 ml víz/acetonitril/dibutil-amin (75:250,03 M) (foszforsawal pH 7,8-ra beállítva) oldószerelegyben oldjuk, az oldódást tetrabutil-ammónium-hidroxid hozzáadásával segítjük elő. Az oldatot 2,8 x 59 cm-cs „Michel-Miller” HPLPLC üvegoszlopra visszük fel, mel) ü 25—40 mikronos LiChroprep RP-8-cal [szilikagéihez kémiailag kötött szénhidrogén fázis (Cj), MC/B Manufacturing Chemists, Inc., Cincinnati, OH]. „FMI” szivattyút alkalmazva az oszlopot 5 ml/min sebességgel (241 kPa) eluáljuk a minta feloldásához használt oldószerrendszerrel. Az eluátumol „ISCO Model UA—5” UV detektorral ellenőrizzük 254 nm hullámhosszon. Egyes 27 ml-es frakciókat a B faktor jelenlétére nézve analitikai HPLC-vel elemzünk 4,6 x 250 mm-es rozsdamentes acél-oszlopon, melyet 10 mikronos LiChrosorb RP-18-cal töltöttünk meg (kereskedelmi forgalomban levő fordított fázisú szilikagél, E Merck, Darmstadt, NSZK). A mintát „Rheodyne Model 7120” precíziós fecskendővel visszük fel. Az oldószert [víz/acetonitril/dibutil-amin 82:18:0,034M, foszforsavval pH 2,5-re beállítva] 1 ml/min sebességgel (5175 kPa) vezetjük át „Constametric III” szivattyú segítségével (LDC-Laöoratory Data Control, Division of Milton Roy Co., Riviera Beach, FL 33404). A B faktort 225 nm hullámhosszon detektáljuk „LDC Spectro Monitor IIP változtatható hullámhosszú UV detektort használva. Az RP-9 oszlop B faktorban dús 996-1296 ml eluátumát 200 ml-re bepároljuk. A koncentrátumot- 500 ml-re hígítjuk, foszforsavval pH 2,0-re állítjuk be és ion-jelzőként NaCl-ot (1 mg per ml) adunk hozzá. Ezt az oldatot 20 ml/min sebességgel oszlopba (2,8 x 22 cm) töltött 100 ml Diaion HP-20 gyantán vezetjük át, melyet előzőleg vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot vizes hangyasavval pH 2,5-re beállított vízzel 500 ml) mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Ezután az oszlopot 1 liter víz/acetonitril (6:4) eleggyel eluáljuk 30 ml/min sebességgel. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepáiolva és liofilizálva 295,6 mg nyers B faktort kapunk. E preparátum 285 mg-ját melegítés közben 30 ml dimetil-formamid/víz (4:6) elegyben oldjuk, lehűtjük, szobahőmérsékletre, majd további hűtéssel a B fal tort kicsapjuk. A csapadékot leszűrve, acetonnal mcsva és vákuumban szárítva 84 mg B faktort kapu ík. Az A41030 antibiotikum B faktor fehér szilárd anyag, melynek hozzávetőleges elemi analízise a következő: 58,54% szén, 4,21% hidrogén, 8,63% nitrogén, 5,96% klór és — a különbségből — 22,66% oxigén. A B faktor 66%-os vizes dimetil-formamid-ol latban elektrometriás titráláskor két titrálható csoport jelenlétét mutatja körülbelül 5,6, illetve 7,5 pKa értékkel, és lehetséges további pKa értékekkel 10 felett (kezdeti pH 6,22). A gyors atom-bombázást alkalmazó tömegspektrometriával („fast atom bombardment mass spectrometry”) kapott molekulatömeg körülbelül 1197. Az elemi analízis és a mért molekulatömeg alapján a B faktornak a Cj * üt s Clj N7 Oi * tapasztalati képletet tulajdonítjuk. Az A41030 B faktor KBr pasztillában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a mellékelt rajzok 192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
