192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 Az A41030 komplex az előzőleg le nem írt Streptomyces Virginiáé NRRL 15156, Streptomyces Virginiáé NRRL 12525 mikroorganizmusok, vagy ezek egy A41030-at termelő mutánsának vagy variánsának tenyésztése útján állítható elő asszimilálható szén-, nitrogénforrásokat és ásványi sókat tartalmazó táptalajban, süllyesztett (szubmerzíós) aerob fermentálási körülmények között, jelentős szintű antibiotikus aktivitás képződésének eléréséig. Az antibiotikus aktivitás nagy része a fermentfolyadékban található, míg kisebb mennyiségű antibiotikus aktivitás kötődik a micéliumhoz. Az A41030 komplexet a fermentációs közegből legkönnyebben a micélium, azaz a biomassza szűrés útján való eltávolításával szeparáljuk. A micéliumot általában eldobjuk. Ezután az antibiotikum komplexet a leszűrt fermentfolyadékből előnyösen oszlopkromatográfiával izoláljuk, alkalmas adszorbenst és például metanol/víz (1:1) eluenst használva. Alkalmas adszorbens például a szén, alumínium-oxid, anion- és kationcserélő gyanták, szilikagél, poliamid, karboxi-metil-cellulózok, erősen pórusos sztirol/divinil-benzol kopolimerek, mint Diaion HP-20, az Amberlite XAD gyanták, és a Duolite gyanták, mint az ES-865 és hasonlók, valamint Sephadex gyanták, dextrán térhálósításával nyert hidrofil, oldhatatlan, molekulaszűrő kromatográfiás anyagok, és TSK gélek is. A Diaion gyanta a Mitsubishi Chemical Industries, Ltd. (Tokio, Japán) terméke. Az Amberlite XAD gyantákon Rohm-és Haas (Philadelphia, Pa.) állítja elő. A Duolite gyanták a Diamond Shamrock (Redwood City, Ca.) terméke. A Sephadex gyantákat a Pharmacia Fine Chemicals AB (Uppsala, Svédország) állítja elő. A TSK gélek a Merck cégtől (Darmstadt, NSZK) és a Bio-Rad cégtől (2200 Wight Ave., Richmond, Ca., 94804) szerezhetők be. Az A41030 antibiotikum komplex tovább tisztítható és kromatográfiás eljárásokká az egyes faktoraira választható szét. A Streptomyces Virginiáé NRRL 12525-ből vagy az S. Virginiáé NRRL 15156-ból számos különböző táptalajban állítható elő az A41030 komplex. Mégis a termelés gazdaságossága, az optimális kitermelés és a termék könnyű izolálhatósága érdekében előnyben részesítünk bizonyos táptalajokat. E táptalajoknak asszimilálható szén-, nitrogénforrásokat és szervetlen sókat kell tartalmazniok. Alkalmas szénforrás például a dextrin, keményítő, mannóz, glicerin és gyapotmagolaj. A szénforrás optimális szintje mintegy 2—3 tömegszázalék. Előnyös nitrogénforrás például a szójababdara, szójababliszt, földimogyoróhszt, halliszt, hús-pepton és sertésvérliszt. Az organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges létfontosságú nyomelemek a tápközeg egyéb komponenseiben szennyezésként fordulhatnak elő, az organizmus növekedési és biosztintetizáló igényeinek fedezésére elegendő mennyiségben. Mégis előnyös lehet a tápfolyadékhoz kiegészítésképpen oldható szervetlen sókat hozzáadni, amelyek nátrium-, kálium-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, foszfát-, szulfát-, nitrát és hasonló ionokat szolgáltatnak. A fermentációs közeghez 2-4% Tween-80 (olajos folyékony poiioxietilén-szorbitán-inorrooleát, ICI Americas, Inc., Wilmington, Del.,terméke) hozzáadása a kitermelést mintegy 300%-kal növeli. Ilyen körülmények között azonban nehéznek bizonyult az A41030 antibiotikum izolálása. Bár kis mennyiségű, A41030 antibiotikum előállítható rázatott lombikos tenyésztéssel, mégis jelentős mennyiségű A41030 antibiotikum előállításához előnyben részesítjük a tankokban történő szubmerziós aerob fermentálást. Tank-fermentáláshoz előnyösen vegetativ inokulumot használunk. Az utóbbit úgy állítjuk elő, hogy kis mennyiségű táptalajt a spóra-formával vagy micélium-töredékekkel oltunk be és így az organizmus friss, aktívan növő tenyészetéhez jutunk. A vegetatív inokulumot azután megfelelő inkubálási idő után átvisszük nagyobb tankba, ahol az A41030 antibiotikum optimális kitermeléssel képződik. Egy másik módszer szerint a vegetatív táptalaj számára úgy állítunk elő inokulumot, hogy a vizes spóraszuszpenzió helyett liofilizált pelletet alkalmazunk. Liofilizált pelietek a szakirodalomból ismert módon állíthatók elő. A liofilizálandó spóra-szuszpenziót hasonlóan készítjük el, mint a vizes spóra-szuszpenziót, azzal a különbséggel, hogy steril desztillált víz helyett steril boíjúszérumot használunk. Az A41030 antibiotikumot termelő organizmus széles hőmérséklet-tartományban, 10-34 °C között tenyészthető. Az A41030 antibiotikum komplex optimális termelése mintegy' 30 °C-on megy végbe. Amint az aerob szubmerzíós tenyésztéses eljárásoknál szokásos, steril levegőt diszpergálunk át a táptalajon. Az organizmus hatékony növekedéséhez a tank-eljárásban használt levegő térfogata mintegy 0,1-0,5 térfogat levegő per táptalaj-térfogat per perc (v/v/min), percenkénti mintegy 100—300 fordulatszámú keverés mellett. 100 liter fermentáló közeget, tartalmazó 165 literes tartályban az optimális levegőbevezetés körülbelül 0,25 v/v/min, mintegy 200 fordulat/min sebességgel forgó keverőlapáttal létrehozott keverés mellett. Az antibiotikus aktivitás általában már 48 óra múlva kimutatható és a fermentálási periódus folyamán legalább 144 óráig megmarad. A maximális antibiotikum-termelés körülbelül 96—120 óra fermentálás alatt következik be. Az A41030 antibiotikum termelése a fermentálás alatt akár agar-diffúzióval követhető B. subtilist használva, vagy turbidimetriás módszerrel Staphylococcus aureus ATCC 9114-et alkalmazva. A találmány szerinti antibiotikum komplexet és egyedi faktorait vagy S. Virginiáé NRRL 15156, vagy S. Virginiáé NRRL 12525 alkalmazásával állítjuk elő, lényegileg azonos hőmérsékletet, időtartamot és táptalaj-adalékokat alkalmazó fermentálási körülmények között. Mégis úgy tűnik, hogy ilyen körülmények között az S. firginiae NRRL 12525 az antibiotikum komplexet valamivel bőségesebben termeli. A találmány teljesebb ismertetésére szolgálnak a találmány hatókörét nem korlátozó alábbi példák. 1. példa Első fokozatú inokulum előállítása A következő táptalajt készítjük el a Streptomyces Virginiáé NRRL 12525 és a Stretomyces Virginiáé 192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
