192107. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enkefolináz-gátló hatású szubsztituált depeptidek előállítására
1 ben a só nem oldódik, vagy olyan oldószerben, amely vákuumban eltávolítható vagy fagyasztással szárítható. Az előzőekben akár a közbenső termékek, akár a kívánt végtermékek előállítására leírt reakciók ha vízképződéssel járnak, például a kondenzációs reakciók, akkor megfelelően magas forráspontú oldószerrel azeoptróp desztillációt alkalmazhatunk, vagy a reakciót dehidratáló szer, például molekulaszita jelenlétében hatjuk végre. A találmány szerinti vegyilletek fenti módszerekkel való előállításánál alkalmazott különféle intermedier a kereskedelemben, például a Chemical Dynamics Corporation-nál kapható, vagy az előállításuk apeptidekre vonatkozó vagy az általános kémiai irodalomban, például Jone, J.H.: Comprehensive Organic Chemistry című könyvében (2. kötet, 819-823 oldal (1979), 1 2. és 29—31. irodalmi utalás) és a Tetrahedron Letters No. 4., 1978, 375—378. irodalmi helyen megtalálható. A fentebb ismertetett vegyületek aszimmetriáé szénatomjuknál kiiálisak lehetnek. Általában a leírt eljárásokkal előállított vegyületek olyan vegyületek diasztereomer elegyei, amelyek legalább egyik aszimmetrica centrumukban D- vagy L- konfigurációjúak. A diasztereomerek elválasztását az irodalomban ismert módszerekkel végezhetjük. így például a megfelelő vegyületeket fizikai módszerekkel, így kristályosítással vagy kromatográfiásan vagy diasztereomer só képzést követő frakcionált kristályosítással választhatjuk szét. A találmány kiteljed az ismertetett cüpeptidek minden, az L igénypontban feltüntetett sztereomer formájára. Azok a vegyületekelőnyösek.amelyekkonfigurádója a természetes L-aminosavakéhoz hasonló. Általában a természetes aminosavakat a Cahn-Ingold-Prelog rendszernek megfelelően S-konfigurációjúnak jelöljük. Egy említésre méltó kivétel a cisztein, amely természetes aminosavés R-konfigurációjú. A találmány szerinti dipeptidek az enkefalináz aktivitását gátolják. Néhányat közülük alkalmasnak találtunk patkány striatából származó enkefalináz A gátlására. Az in vitro vizsgálatokban ezek a vegyületek 10— 10-6 mólos koncentrációban az említett enzim kativitását 50%-kal vagy többel csökkentették. Az említett vizsgálatokban fiatal hím Sprague-Dowlex patkányok agyából Gorensteín, C. és munkatársai: Life Sciences, 25. kötet, 2065-2070. oldalon (Pergamon Press, 1978) leírt módon elkülönített e.ikefalinázt alkalmaztunk. Ebben az eljárásban az agyban lévő, különböző enkefalin lebontó enzimeket egymástól elválasztjuk a Gorenstein és Synder által leírt eljárással (Life Sciences, 25. kötet, 2065-2070 oldal, 1979). Egy fiatal Sprague-Da wley patkány agyát (minus cerebellum) először 30 térfogat 50 mM-os Tris-pufferben, pH 7,4- en homogenizáltuk. A kapott homogenizátumot 50 000 g-nál 15 percig centrifugáljuk és a membránhoz kötött enzim anyagot Tris-ben újra szuszpendáljuk és mossuk és centrifugáljuk a fentiek szerint négy alkalommal. A membrán labdacsot 15 térfogat /az eredeti agy súlyára vonatkoztatva) 50 mM-os Tris-1% Triton X-100 puffer jelenlétében pH 7,4-en, 45 perces és 37°C-on végzett inkubálással szolubilizáljuk. Az elegyet 60 percig 100 000 g-nál centrifugáljuk, a nem szolubilizált anyag eltávolítására, a Triton-oldható felülúszót 2 í ,5 x 30 cm-es DEAE Sephacel oszlopra rétegezzük, amelyet előzőleg 50 mM-os Tris - 0,1% Triton pufferrel (pH = 7,4) egyensúlyba hoztunk. Az oszlopról az anyagot 1 liter 0,0-tól 0,4 M közötti lineáris nátrium-kíorid gradienssel eluáljuk. Az eluátumokat 7 ml es frakciókban gyűjtjük, amelyek mindegyikének megvizsgáljuk az enkefalináz aktivitását. Ilyen körülmények között az enkefalináz ,A” aktivitást (dipepridil4carboxi-peptidáz) a 120 és 220 ml közötti eluátumban találjuk, amelyet az aminopeptidáz aktivitás követ (260 ml — 400 ml), majd az enkefalináz ,3” aktivitás (dipeptidil aminopeptidáz) 420 és 450 ml között. A meghatározásnál az enkefalináz aktivitást radionetriásan követjük. A szubsztrát 3H-met-enkephalin (50,1 Ci/mmól, NEN), amelyet 0,05 M-os Tris pufferrel (pH 7,4) hígítunk úgy, hogy a reakcióelegy végső koncentrációja 40 nM. A reakcióelegy teljes térfoga‘a, beleértve az enzimet és szubsztrátot 250 ml. Az inkubálást 37°C-on 90 percig végezzük. A reakciót úgy állítottuk le, hogy a csöveket fonó vízfürdőbe helyezzük 15 percre. A reakcióelegy 4 ml-es részletét azután Baker-Flex Silica Gel IB lemezre cseppentjük (20 x 20 cm) inaktív met-enkafalin, tirozin, tirozü-glidn, tirozil-glicál-glicin standardokkal együtt és a komponenseket izopropanol etil-acetát:5 s/tf.% ecetsav 2:2:1 elegyével ícromatografáljuk, amely oldószer képes a met-enkefalint a bomlástermékeitől elválasztani. A teljes kifejlesztési idő körülbelül 17 óra. A firtatás előtt a kifejlesztéshez használt futtatókádat nitrogéngázzal átfuttatjuk. A kifejlesztést követően a foltokat ninhidrinnel hívjuk elő. Ezeket a foltokat és a lemez további részéről a megfelelő anyagot tartalmazó adszorbens részt a lemezről eltávolítjuk és a foltoknak megfelelő radioaktivitást szcintillációs számlálóval mérjük. Így meghatározzuk a tirozint, tirozil-gli:int, tirozil-glidl-glicint és met-enekefalint tartalmazó foltok radioaktivitásának nagyságát. Minden lemezre vonatkozóan az egyes foltok radioaktivitását a lemezről összegyűjtött összes radioaktivitás százalékában fejezhetjük ki. A met-enkafalinnak enzimek távollétéban végbemenő természetes bomlása hatásának kiküszöbölésére enzim nélkül is végeztünk vizsgálatot és az ilyen vizsgálat eredményeként a tirozin, tirozil-glicin, tirozilgliál-glicin foltjainak százalékban kifejezett radioaktivitását levontuk az enzimmel végzett vizsgálatok eredményeként a megfelelő kísérleti mintákra kapott rádioaktivitás értékekből, a kapott értékek összege adja a netto termék százalékot minden egyes futtatásra. Azért, hogy a különböző dipeptidek egymáshoz viszonyított hatásosságát értékelni tudjuk, minden egyes dipeptidre vonatkozó, a dipeptid jelenlétében (P) és a dipeptid távollétében (A) végzett vizsgálattal kapott nettó tennék %-ot az (A—O) (A) képletbe behelyettesítjük. Az így számított értékek következtetni engednek a különböző dipeptidek egymáshoz viszonyított gátló hatására. Az in vivo kísérletekben is megfigyelhető, hogy ha a találmány szerinti vegyületeket parenteráÚsan adagoljuk 5-100 mg/kg dózisban egérnek, az intracerebralisan adagolt D-Ala-met-enkefalinamid analgetikus hatását potendrozzák. Az irodalomban ismert bármilyen formájú gyógyászati készítményt előállíthatunk, így tablettákat, kapszulákat vagy elixireket orális adagolásra és steril oldatokat vagy szuszpenziókat parenterális adagolásra. 192.107 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
