192068. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szabad és antitesthez kötött ligandum szétválasztására
1 192.068 2 Tmmunmeghatározások kivitelezésének leegyszerűsödése a felhasználó számára, részint a különféle radioimmun használata terén, így például a különböző típusú radioimmun meghatározásoknál. Az alábbi kiviteli példák a főbb alkalmazási lehetőségek bemutatását szolgálják. 1. példa Pankreászglukagon radioimmun meghatározása plazmában: 0,5 ml vérpaizmát 0,1 ml hígított anti-glukagon nyulszérummal 2 napon keresztül 4vC-on, majd 0,05 ml 1 *5 J -glukagonoldat hozzáadása után 20 órán keresztül 4°C-on inkubálunk. Ezután a B/F-elváalsztás érdekében 0,1 ml Rab—IIPR-t dunk hozzá és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd 2.0 ml 1,6 mól/liter (NH4)2S04-t a tesztpufferhoz hozzákeverünk s azután ismét 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az ezt követő 15 perces, 2000 g-os centrifugálás után a felülúszó a szabad, 135 J jelzett glukagont (F) tartalmazó felülúszót leöntjük és a csapadék radioaktivitását lemérjük. A fentiek szerint kivitelezett pankreászglukagon - R1A — 3,4 ± 0,4% nemspecifikus í35J-glukagon megkötődés mellett és a precipitációs index 3,4 ± 0,3% (T ± standard mérési hiba, n * 14/értéke mellett - az inkubátumhoz adott 100 pikogramm glukagon hatására a kötött, l35J-glukagon (B) értékének 38%-osra való csökkenését mutatta ki a glukagon távollétében mért B értékhez képest 2. példa Inzulin radioimmun meghatározása a vérplazmában: 0,05 ml vérplazmát 0,1 ml hígított anti-inzulin tengerimalac szérummal 20 órán keresztül szobahőmérsékleten, majd 0,1 ml 13 5 J -inzulin hozzáadása után további 90 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a kötött és a szabad ligandum elválasztására 0,1 ml GP— IIPR-t adunk az inkubátumhoz és szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk az elegyet. 2.0 ml 1,36 mól/liter töménységű ammóniumszulfátoldatot mérünk a tesztpufferbe, s azzal összekeverve, ismét 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az ezt követő centrifugálás (15 perc, 2000 g) után a 13 5 J-inzulint (F) tartalmazó felülúszót elöntjük és a csapadék radioaktivitását (B) mérjük. Az inzulin fenti módon végrehajtott R1A- meghatározása — 2/45 ± 0,05% l3íj-inzulin nemspecifiku» kötődés és 2,6 ± 0,3% (+ t standard mérési hiba, n « 7) precipitációs index mellett - 300 pikogramm (0,3 g uE) inzulinnak az inkubátumban való jelenléte «étén azt mutatja, hogy a kötött 13$J-inzulin (B) érteke 12,6 %-ra csökken - szemben a jelöletlen inzulin távollétében mért B-értékkel. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 10 1. Eljárás szabad és antitesthez kötött ligandum szétválasztására, jelölt ligandumos immunmeghatározások kivitelezésénél, azzal jellemezve, hogy a szétválasztandó elegyhez egy Jigandumspecifikus ellenszérumot adó donorállat normálszérumának (NS) 15 egy ezen állatfaj immunglobulinjaival szemben specifikus antitestet (AK2) tartalmazó ellenszárummal való inkubálásával előállított immun-immobüizált precipitációs reagenssel (IIPR) inkubáljuk, majd az elegyet ammónium-szulfát vagy polieülén-glikol hozzá-2a adása után inkubáljuk, végül centrifugáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IIPR-t a homogén fázisú, ligandumspecifikus immunreakció lezajlása után, finomdiszperz immunprecipitátum formájában keverjük az elegyhez................................................................ 25 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyazon ampullában, de az egymással való elegyedé kizárásával liofilizált két komponensből (NS és AK2) közvetlenül alkalmazás előtt, pufferben való oldással előállított IIPR-t használunk. 30 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal j ellemezve, hogy a szétválasztást tengerimalac-IIPR-rel vagy nyúl—IIPR-ral végezzük. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljáás azzal jellemezve, hogy az ammónium-szulfátot 1,16 mól/1 végkoncentrációban, a polietilén-glikol 35 6000-et 30 g/1 végkoncentrációban adjuk az elegyhez majd legfeljebb 30 percen át inkubáljuk. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy hindumként egy, az AKj-et adó donorállat vérplazmájában előforduló li-40 gandumoktól eltérő olyan anyagot használunk, amelylyel szemben közvetlenül, vagy egy hordozóanyaggal való kapcsolódása után specifikus antitestek termelődnek, és amely a ligandum-immun meghatározás során antigénként vagy hapténként reakcióba lépni képes. 45 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aligandumot magát vagy egy antigén, illetve haptén Iigandumspecifikus szerkezeti egységet a specifikus antitesthez való kapcsolódási képesség megőrzése mellett érzékenyen cn mérhető markerrel - célszerűen radioaktív izotóppal vagy egy enzimmel — jelölve használjuk. ábra nélkül Országos Találmányi Hivatal F Je.: Himer Zoltán Kódex 4
