191984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibridómák és ezek segítségével antitestek előállítására
7 191984 8 nómához és a többieket a jelen találmány szerinti szüló-sejtvonalhoz (ME1), amelyet a hibridóma készítéséhez alkalmazunk. A jelen találmány szerinti hibridóma készítéséhez szükséges új tumor sejtvonal készítésének módszerét, az ezt a sejtvonalat szüló-sejtvonalként használó hibridóma készítésének módszerét és ebből a hibridómából hasznos biológiai anyagok előállításának folyamatát írjuk le a későbbiekben. A jelen találmány szerinti hibridóma készítéséhez a szülő sejtvonalat a csontvelő sejtekből származó tumor sejtektől eltérő tumorsejtek természetes mutációjával vagy indukált mutációjával nyerhetjük, ilyen humán tumor sejtek főleg humán melenóma sejtek, humán nyelvrák sejtek és humán hepatóraa sejtek lehetnek. A jelen találmány szerinti hibridómát ennek az új sejtvonalnak egy másik szülő-sejtvonallal, vagyis partnerrel történő fúziójával készíthetjük, amely partner származhat pl. állatok B-sejtjéből, beleértve a szóban forgó antigénnel immunizált embert is. Az egyszerűség kedvéért a jelen találmányt az alábbiakban úgy írjuk le, hogy főleg humán tumor sejtek egér lépsejtekkel történő fúziójával készített hibridóma tenyészetéből nyert monoklonális antitest (MoAb) termelésének kivitelezésére utalunk. Meg lehet érteni azonban, hogy a jelen találmány semmiképpen sem korlátozódik erre a szóban forgó kivitelre. A humán tumor sejtek, amelyek szüló-törzsként szolgálnak a hibridóma készítéséhez, előállításának folyamata egy, a DNS szintézis mentő ciklusában érdekelt enzim (HGPRT)-hiányos klón izoláláséval kezdődik abból a célból, hogy lehetővé váljon hibridómák ezt követő HAT-szelekciója. Ezt a lépést a következő két módszer egyikével lehet végrehajtani. Az egyik módszerben közvetlenül 8-azaguanint adunk megfelelő koncentrációban a tápközeghez úgy, mint 8-azaguanin rezisztens törzsek nyeréséhez. Egy másik módszerben ráksejteket vagy UV besugárzással vagy mutációs induktorral kezelünk a ráksejt fajlagos típusától függően, és az így kezelt sejteket ezt követően visszük ét egy 8-azaguanint tartalmazó tápközegbe. Az UV besugárzást úgy hajtjuk végre, hogy a sejteket UV lámpa (GL-15)-fényének tesszük ki 30 cm távolságból 15 másodperc és 10 perc közti időtartamokra. Egy megfelelő mutációs induktor az etilmetánszulfonát (EMS) vagy az N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin (MNNG), ezeket 0,05-10 /ug/ml mennyiségben alkalmazzuk. Miután a sejteket a mutációs induktor jelenlétében tenyésztettük több órától 3 napig terjedő időtartamokon át, a tenyészetet szérummentes tápközeggel alaposan átmossuk és átvisszük egy 8-azaguanint tartalmazó tápközegre. Bármelyik módszert használjuk, a folyamat első lépése egy vagy több 8-azaguanin-rezisztens törzs megjelenésével végződik. A második lépés ellenőrzésből áll, hogy megláthassuk, vajon a 8-azaguanin rezisztens törzs sejtjei lehetővé teszik-e az ezt követő HAT-szelekciöt. A 8-azaguanin rezisztens törzseket megfelelő tápközegben tenyésztjük, amelyet azután centrifugálással eltávolítunk. A fennmaradó sejteket azután kétszer mossuk megfelelő tápközegben, majd átvisszük friss HAT tápközegbe (105 sejt/ml). 5 napos inkubálás után a sejteket triptán-kékkel megfestjük. Ha csaknem az összes sejtet elpusztultnak találjuk, az azonos 8-azaguanin- rezisztens törzs sejtjeit (105 sejt/ml) Costar 3596 lemezre (mikro-lemez 96 üreggel) helyezzük el, miután 105 betápláló sejtet (azaz lépsejtet) helyeztünk el minden egyes üregbe. A lemezre helyezés előtt a 8-azaguanin rezisztens sejteket olyan koncentrációra hígítjuk, hogy biztosítva legyen, hogy egynél több sejt ne legyen az egyes üregekben (valószínűség alapján 0,1 sejt/üreg). A lemezre helyezett sejteket kb. 1 hétig inkubáljuk. A kiónokat hagyjuk szaporodni a sejt-populációban és amikor ezek elérik a 105 sejt/ml koncentrációt, ezeket ismét HAT tápközeggel hozzuk össze, majd addig hagyjuk, amíg mind elpusztulnak. A fenti eljárást előnyösen legalább kétszer megismételjük. A második lépés a 8-azaguanin rezisztens sejtek teljes pusztulásának bizonyságával végződik HAT tápközegben. Szükséges, hogy 8- -azaguanint mindig tegyünk a HAT tápközegbe, amíg a kívánt sejtvonalat létrehozzuk. A fenti eljárásban 8-azaguanint helyettesíteni lehet BudR-el (bróm-dezoxi-uridin) ahol TK-ban hiányos és HAT tápközegre ismét érzékeny kiónok nyerhetők. A kívánt sejtvonal létrehozása után ezt olyan tápközegben kell tartani, amely 8-azaguanint tartalmaz, ha alkalmas. A létrehozott sejtvonal tenyésztéséhez szükséges tápközeg lehet ugyanolyan, mint amilyent a humán tumor sejt mutációja előtt használtunk. Sőt, a létrehozott sejtvonalat lehet használni szülő sejtvonalként a hibridóma-készítéshez anélkül, hogy ehhez speciális tápközegre lenne szükség. A létrehozott sejtvonalat megfelelően lehet tárolni hagyományos módszerrel, egy 10% FCS-et (borjú-embrió szérum) és 10% DMSO-t (dimetil-szulfoxid) tartalmazó tápközegben szuszpendálva, amelyet ezután vagy folyékony nitrogénben tartunk, vagy egy fagyasztóban -80 °C vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A jelen találmány szerint létrehozott sejtvonal alkalmas szülő sejtvonalként egy hibridóma előállításához. Ha a sejtvonal humán tumor sejtből ered, ez alkalmas lesz szülő sejtvonalként humán-humán hibridóma előállításához. A másik szülő (partner-sejt) lehet a szóban forgó antigénnel immunizált ember perifériás véréből, mandulájából, nyirokcsomójából és lépéből származó B-sejt. A humán-humán hibridómáknak egyik nagy előnye az, hogy olyan immunglobulinok előállitá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
