191984. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibridómák és ezek segítségével antitestek előállítására
3 191984 4 A jelen találmány tárgya eljárás új hibridómák előállításéra, továbbá egy eljárás hasznoB vegyületek, pl. antitestek vagy lirafokinek előállítására az új hibridómák tenyésztésével. Az immunológia, biológia, orvostudományok és a farmakológia területén intenzív erőfeszítéseket tesznek diagnosztikai ágensként vagy terápiás ágensként olyan homogén és erősen fajlagos antitestek (monoklonális antitestek) alkalmazására, amelyeket in vitro körülmények között nőni képes és fajlagos antigének elleni antitestek képzésére alkalmas hibridóma törzsekből állítanak elő. Az ilyen hibridómák előállításának lehetőségét és ezek felhasználását biológiai anyagok in vitro termelésében először Ceaser Milstein és munkatársai mutatták meg a Cambridge Egyetemen (Milstein C. és munkatársai: Nature, 256, 495). Mutáns sejtvonalat (P3-X63-Ag8) állítottak elő egér mielóma törzsből (P3K), amelyet a Salk Intézetből Leo Sacks biztosított. A mutáns sejteket ezután egyesítették birka vörösvérsejttel (SRBC) immunizált egér lép-sejtekkel. Az így nyert hibridóma képesnek mutatkozott in vitro nőni és SRBC-re monoklonális antitesteket (MoAb) előállítani. A hibridómák alkalmazásának az a nagy előnye, hogy eszközül szolgálhat biológiailag aktív vegyületek tömegtermeléséhez olyan módon, hogy nagy burjánzási képességgel rendelkező tumor-sejteket egyesítenek olyan sejtekkel, amelyek a megfelelő biológiailag aktív anyagot képesek termelni, de amelyek in vitro általában csak csekély burjánzási képességgel rendelkeznek, vagy egyáltalán nem rendelkeznek burjánzási képességgel. Milstein és munkatársainak közleményeit követve számos kutató végzett tanulmányokat fajlagos antigének elleni MoAb termelő hibridómákkal. Mindezekben a tanulmányokban a hibridómák készítésében használt szülő-törzsek csontvelő sejtekből származó tumor-sejtek voltak, mint pl. mielóma sejtek vagy B-sejtekböl származó tumor-sejtek. Az olyan tumor-sejteknek, mint a mielóma sejt, genetikai tulajdonságait, amelyek a hibridóma előállításéhoz ás a hibridóma-készítéB elméleti szempontjaihoz szükségesek, az alábbiakban részletesen leírjuk. Egy hibridóma előállításához két vagy többféle szülősejtből az első követelmény egy olyan rendszer alkalmazása, amelyben csak a hibridizált sejt képes túlélni, a szülősejtek túlélése tehát megakadályozott. Ezért a hibridómák előállítására irányuló kísérletek nagy részében a tumor sejtek amelyek élénken képesek növekedni in vitro, olyan mutáns sejtek, amelyek hiányosak vagy hipoxantin-guanin foszforibozil transzferázban (HGPRT) vagy timidin-kinázban (TK). Mindkét mutáns genetikai és biokémiai tulajdonságai lényegében azonosak, így az ez után következő leírást a sokkal közönségesebb HGPRT-hiányos sejtekre alapozva végezzük. Amint ismeretes, a HGPRT egyike azoknak az enzimeknek, amelyek felelősek minden sejtben a DNS- szintézisért egy mentő-ciklus útján a DNS- szintézis menetében. Részletesebben szólva, ha az enzimes reakcióhoz szubsztrátumként purin vagy pirimidin komponenseket igénylő de novo ciklusban a DNS szintézist bizonyos inhibitorok (pl. aminopteriri) elfojtják, a HGPRT működésbe hozza a mentő-ciklust, mint kisegítő utat és lehetővé teszi a DNS szintézis folytatását a sejt életben tartásához Ennél fogva a HGPRT-hiányos sejtek nem tudnak túlélni olyan tápközegben, amely hipoxantint, aminopterint és timídint tartalmaz (HAT tápközeg) az aminopterin jelenlétének leövetkeztében, amely inhibitora a de novo ciklusnak. A hibridóma készítéséhez szükséges partner sejtek, pl. lép-sejtek (B sejtek) képesek szintetizálni DNS-t mind a de novo, mind a mentő cikluson keresztül. Ennél fogva az a hibridóma, amely a lépsejteknek fúziójával jött létre HGPRT-hiányos szülősejtekkel, túléli a de novo ciklus aminoptérines gátlását HAT tápközegben és hatásosan lehetővé teszi a hipoxantin alkalmazását a DNS szintézisében a lépsejtekből eredő mentő cikluson keresztül. Más szavakkal a hibridóma rendelkezik mind a szülő mielóma sejtnek azzal a képességével, hogy élénken nő in vitro, mind azzal a képességgel, hogy a lépsejtekből eredő mentő ciklus által DNS-t tud szintetizálni még a de novo ciklust gátló körülmények között is, vagyis HAT tápközegben aminopterin jelenlétében. Ezen túl a hibridóma a lépsejtekből olyan genetikai információkkal rendelkezik, hogy immunglobulinokat (antitesteket) termeljen fajlagos antigének ellen, így tehát úgy képes nőni HAT tápközegen, hogy közben immunglobulinokat állít elő. A HGRTP-hiányos törzset, mint a hibridóma-készítés szülőtörzsét általában úgy választják ki, mint egy olyan sejt-vonalat, amelyet a megfelelő mutációs technikával létre lehet hozni és amely rezisztens 8-azaguanidinre és amely nem képes nőni a HAT tápközegen. Hagyományosan ez a szülőtörzs csontvelőből származó tumor-sejtekből, mint pl. mielóma sejtek vagy B sejt limfómák, áll. A legtöbb tumor-sejt azonban, amelyet klónozni lehet a hibridóma-készitésben történő felhasználáshoz, egérből vagy patkányból származik és a humán mielóma sejteket ritkán használják. Ennek okai a következők: 1.) olyan kiónokat, amelyeket a HAT tápközegben történő szelekciónak (a továbbiakban ezt HAT szelekciónak nevezzük) ki lehet tenni, nehéz készíteni humán mielóma sejtekből; 2.) a humán mielóma sejteknek nincs meg az a burjánzási képessége, amely egy szüló-sejtvonalhoz szükséges, így egy olyan hibridóma, amelyet ebből a sejtvonalból és egy partner sejtvonalból fúzióval készítenek, csupán korlátozott növekedési képességei rendelkezik, ezen túl ez nem is elég stabil ahhoz, hogy nagy mennyiségű kívánt anyagot, pl. immun5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
