191865. lajstromszámú szabadalom • Eljárás LH-RH antagonista peptidek előállítására
1 191 865 2 ban alkalmazzuk őket, és hatásosan segítik elő a megtermékenyített peték reszorpcióját is, röviddel a fogamzás után alklalmazva. E peptidek hím emlősök kontraceptív kezelésére is használhatók. Közelebbről meghatározva, a találmány szerint elő- 5 állított peptidek a következő általános képlettel ábrázolhatok: X-0—D-2NAL— Rj —D-Trp—Ser—Rs -R« -R7 - Arg-Pro—R10, ahol 10 X 1-4 szénatomos alkanoilcsoport vagy benzoilcsoport, R2 jelentése 4-Cl-D-Phe, 4-F-D-Phe, 4—N02 — D-Phe vagy 4-Br—D-Phe; R5 jelentése Tyr vagy 2-Cl-Phe; 15 Rß jelentése D-Arg vagy 4-NH2 -D-Phe; R7 jelentése Leu vagy NaME-Leu; és R10 jelentése Gly—NH2, -NHCH2CH3 vagy D—Alá—NH2. ß—D—NAL alatt az alanin D-izomerjét értjük, melyet 20 a /3-szénatomon naftilcsoport szubsztituál. Előnyösen a ß—D—2NAL aminosavat alkalmazzuk, ami azt jelenti, hogy a /3-szénatom a naftalinhoz a gyűrűszerkezet 2- helyzetében kapcsolódik. A találmány szerinti peptidek klasszikus eljárással 25 oldószerben szintetizálhatok, vagy szilárd fázisú technikával állíthatók elő klórmetilezett gyantát, metil-benzhidril-amin-gyantát (MBHA) vagy benzhidril-amin-gyantát, (BHA) használva. A szilárd fázisú szintézist lépésenkénti módszerrel hajtjuk végre, a láncot egyenként 30 növelve a soron következő aminosav hozzákapcsolásával (az eljárást részletesen ismerteti a 4,211,693 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). í Előnyösen a peptidkémiában jól ismert oldalláncvédő ; csoportokat adunk a Ser, Tyr, Arg és His aminosavak-:35 hoz, mielőtt hozzákapcsolnák őket a gyantán épülő j lánchoz. Az ilyen eljárás teljesen védett intermedier1 peptidgyantát eredményez. A találmány szerinti intermedierek a következő általános képlettel szemléltethetők: 40 X-0-D—2N AL-R2 —D—Trp(X2 )-Ser-(X3 )Rs (X4 y-Re (Xs )-R7 -Arg(X5 )-Pro-X6, ahol X2 hidrogénatom, vagy az indol-nitrogén védőcsoport- 45 ja, például formil- vagy benzilcsoport; sok szintézisnél azonban nincs szükség a Trp megvédésére. X3 hidrogénatom vagy a Ser alkoholos hidroxilcsoportjának védőcsoportja, és jelentése például acetil-, benzoil-, tetrahidropiranil-, ferc-butil-, tritil-, 50 benzil- vagy 2,6-diklór-benzil-csoport. Előnyben részesítjük a benzilcsoportot. X4 . hidrogénatom vagy a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának védőcsoportja és jelentése például tetraliidropiranil-, tere-bűül-, tritil-, benzil-, benzil-oxi-karbo- 55 il-, 4-bróm-benzil-oxi-karbonil- vagy 2,6-diklórbenzil-oxi-karbonil- vagy 2,6-diklór-benzil-csoport. Előnyben részesítjük a 2,6-diklór-benzil-csoportot. Xs az Arg nitrogénatomjának védőcsoportja és jelentése például nitro-. Tos, benzil-oxi-karbonil-, ada- 60 mantil-oxi-karbonil-csoport vagy Boc. Xs azonban hidrogénatom is lehet, ami azt jelenti, hogy nincsenek védőcsoportok az Arg oldaüáncbeli nitrogénatomjain. Előnyben részesítjük a Tos csoportot. X6- jelentése Gly—0-CH2-[gyantahordozó];-0-CH2 -[gyantahordozó]; D-Ala-OCH2-[gyantahordozó]; Gly-NH-[gyantahordozó]; D-Ala-NH-[gyantahordozó]; és Gly-hez vagy D—Ala-hoz, vagy közvetlenül Pro-hoz kapcsolódó OH-, észter-, amid- vagy hidrazidcsoport. Az X2—Xs oldallánc-védőcsoportok megválasztásának kritériuma, hogy a védőcsoport stabil legyen a reagenssel szemben annak a reakciónak a körülményei között, melyet a szintézis minden lépésénél az a-aminocsopcrt eltávolítására alkalmazunk. A védőcsoportnak nem szabad lehasadnia a kapcsolás körülményei között, és el'ávolíthatónak kell lennie a kívánt aminosav-szekvencii szintézisének befejezése után, a peptidláncot nem befolyásoló reakciókörülmények között. Ha X6 jelentése Gly-0-CH2-[gyantahordozó], D-Ala-0-CH2-[gyantahordozó] vagy -OCH2-[gyantahordozó], a polisztirol gyantahordozó számos funkciós ’ csoportja egyikének észterrésze vesz részt a kötés létrehozásában. Ha az X6 csoport Gly-NH-[gyantahordozó] vagy D-Ala-NH-[gyantahordozó], úgy amidkötés kap: csolja a Gly-t vagy a D-Ala-t a BHA gyantához vagy ' MBHA gyantához. Hr X jelen van a végső képletben, akkor X védőcsoportként használható a D-NALa-aminocsoportjához, és ebben az esetben ezen utolsó minosavnak a peptidlánchoz való kapcsolása előtt alkalmazhatjuk. A teljesen megvédett pepiid a klórmetilezett gyantahordozóról ismert módon ammonolízissel hasítható le és így teljesen megvédett amid-köztiterméket kapunk. ; A peptid védőcsoportjainak eltávolítását, valamint a pep; tid lohasítását a benzhidril-amin gyantáról 0 ôC-on hidro! gén-Tuorid (HF) segítségével hajtjuk végre. A HF-os kezelés előtt előnyösen anizolt adunk a peptidhez. A HF vákuumban való eltávolítása után a lehasított, védőcsoport mentesített pepiidet célszerűen éterrel kezeljük, dekantáljuk, híg ecetsavban felvesszük és liofiiizáljuk. A pepiidet ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk karboxi-metil-cellulóz (CMC)- oszlopon, majd megoszlásos kronatográfiát alkalmazunk Sephadex G-25 oszlopon ; n-betanol/0,1 n ecetsav (1:1 térfogatarány) eluenst hasz; nálva, vagy ismert módon nagyteljesítményű folyadék; kromatográfiai (HPLC) alkalmazunk. : A találmány szerinti peptidek 100 pg per testsúly-kg; nál alacsonyabb dózisszinteken gátolják nőstény patká- i nyok ovulációját, ha déltájban a proösztrusz napján alkalmazzuk őket. Az ovuláció tartós visszaszorítása céljából körülbelül 0,1-2,5 mg per testsúly-kg dózisszintek alkalmazása szükséges. A találmány szerinti antagonisták hatásos fogamzásgátlók akkor is, ha szabályos ütemben hím emlősöknél alkalmazzuk őket. Mivel e vegyületek csökkentik a tesztoszteronszintet (nemkívánatos következmény normális, szexuálisan aktív hímeknél), célszerű lehet tesztoszteron utánpótlási dózisokat alkalmazni a GnRH-antagonistával együtt. Ezen antagonisták más célból is használhatók a gonadotropinok és nemi hormonqk képződésének szabályozására, mint fentebb említettük. 3
