191861. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükóz-tartalmú cukorlé izomerizálására
1 191 861 2 A glükóz-izomerázt oly módon vontuk ki a S. rubigenosusból, hogy 0,35% Maquat MC 1412-t (Mason Chemical Co.), valamint 10 ppm mennyiségű tyúktojáslizozimet adtunk az elegyhez, és 6,3-6,6 pH-érték mellett, 40 °C hőmérsékleten 5 órán át kevertük, majd leszűrtük, és így nyers, tisztítatlan glükóz-izomeráz oldathoz jutottunk. A nyers izomerázt (a 3,823,133 számú amerikai szabadalmi leírás szerint készített) DEAE-cellulózon való adszorpcióval tisztítottuk, azután az adszorbeátumot a szennyezések eltávolítása végett 0,1 M konyhasó-oldattal mostuk, majd pedig 0,45 M töménységű konyhasóoldattal deszorbeáltuk az izomerázt. A tisztítási lépések folyamán mindegyik oldat pH-ját 7,5 értéken tartottuk. Az így kapott részleges tisztaságú izomeráz-oldatot 0 °C-on 3 térfogatrész 95 %-os etanollal összekevertük, hogy az izomeráz kicsapódjék. Ezt követően perlites derítést végeztünk, a szilárd részeket kiszűrtük, és levegőn szárítottuk; így 2500 IGIU/g aktivitású oldható izomeráz készítményhez jutottunk. Az izomeráz készítményt szobahőmérsékleten, milliliterenként 10 mg izomerázt tartalmazó oldat előállítása céljából 1 mM MnCl2- ban feloldottuk és a perlites derítés maradványait szűréssel eltávolítottuk. A k-pott preparátum fajlagos aktivitása 37,3 lGIU/mg protein értékű volt. Oldható poliamin-polimert úgy kaptunk, hogy 39,0 g kitozánt (Kytex a Hercules Inc.-tői, Wilmington, Delaware 19899) 13 liter 0,08n sósavban feloldottunk. Oldódás után a kitozán-oldatot 380 g nátrium-klorid hozzáadásával 0,5M koncentrációjúvá tettük, és az oldat pH- ját 8n nátrium-hidroxiddal 6,15 értékre állítottuk be. Végül a kitozán-oldatot Whatinan-típusú 3 fokozatú papírszűrőn átszűrtük, hogy eltávolítsuk a fel nem oldódott anyagokat. Az ily módon Q,5M nátrium-kloridoldatban oldott, 6,15 pH-jú, 0,3 % töménységű kitozánoldat 13 literéhez a következő anyagokat adagoltuk: 100 ml-nyi, 100,000 IGIU aktivitású oldható izomerázt, 197,6 g xilitet (a Sigma Chemical Co. termékét), és 0,619 g CoCl2.6H20-t. Ezt az elegyet 2 órán át kevertük, majd 6,24 g l-etil-3-dimetil-amino-propil-karbodiimidet (a Sigma Chemical Co.-tői) adtunk hozzá, hogy az izomeráz karboxílcsoportjai több ponton keresztül kovalens kötésekkel kapcsolódjanak a kitozán aminocsoportjaihoz. Újabb 2 óra elteltével, szobahőmérsékleten, 15,6 ml 8n nátrium-hidroxiddal 6,0 pH-ra beállított 50 tömeg% töménységű glutáraldehid-oldatot (az Eastman Kodak termékét) adtunk a reakcióelegyhez az izo;neráz-kitozán kovalens kötésű komplex oldhatatlanná tétele érdekében. 15 perc múlva pedig 2 liternyi 8,0 pH•ú, 1M koncentrációjú foszfát-oldatot adtunk hozzá, 5 hogy elősegítsük a glu táraldehid hozzáadásával létrejött gél megtörését. Az így kapott oldhatatlan izomerázkitozánt Buchner vákuumszűrőn rövid idő alatt ion-, mentes vízzel átmostuk. A készítményt ezután szobahőmérsékleten egy éjszakára száradni hagytuk, majd 10 másnap elporítottuk, és 0,775—0,180 mm lyukbőségű sziták között átszitáltuk. A száraz katalizátor 384IGIU/g aktivitást mutatott. A 105,2 °C-on működő reaktort a következő módon készítettük elő. A katalizátor 13 g-ját a szubsztrátummal 15 szuszpenzióba vittük, és szobahőmérsékleten 60 percen keresztül laboratóriumi vákuum alatt légtelenítettük. A légtelenített zagy felhasználásával kettősfalú üvegkolonnában 1,5X20 cm méretű töltetágyat képeztünk ki. A töltet 4992 IGIU-nak megfelelő aktivitással rendel- 20 kezelt. A 70 °C-on végbement izomerizáció termékét szárazanyagra számítva 42 % töménységűre hígítottuk, és pH- j;it 6,75-re állítottuk be. Ezt az alapanyagot azután 68,9X 103 Pa nyomás alatt, 60°C-on, 1,96 ml/perc se- 25 bességgel 30 percig keringettük a magashőmérsékletű reaktoron keresztül. A kolonnán belüli hőmérsékletet egy közvetlenül a töltet fölött elhelyezett, és a holttér minimalizálása céljából üveggyöngyökkel körülvett hőmérő útján ellenőriztük. Ezt követően a hőmérsékletet 30 106°C-ra termosztált olaj közvetítésével gyorsan megemeltük. A lejövő termék minőségét 50—58 % közötti fruktóztartalom leolvasására kalibrált polariméter-regisztráló műszerrel követtük. Miután a kolonna hőmérséklete 35 a 105,2°C-ot, és a termék fruktóz-tartalma a kívánt szintet elérte, a terméket összegyűjtöttük és azonnal jégfürdőben lehűtöttük, továbbá pH-ját 1M koncentrációjú citromsav hozzáadásával 4,90 értékűre szabályoztuk. A terméket mindaddig gyűjtöttük, amíg a fruktóz- 40 szint 55 % alá nem süllyedt. A 70°C-on, illetőleg 105,2 °C-on működő reaktorok izomerizált termékét szénhidrát-összetételre és színerősségre nézve elemeztük, majd az eredményeket az izomerizálatlan szubsztráturnéval összevetettük. Az összeha- 45 scnlitást az 1. táblázat mutatja be. 1. Táblázat 70 és 105,2 °C-on izomerizáll szubszirátum oldatok összetétele Szénhidrát összetétel (hamumentes szárazanyagra számított tömeg%) Színerősség Kezelési mód Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid Izomerizálatlan 0 97,6 0 2,4 0,5 70 °C-on izomerizált 51,3 46,4 0 2,3 0,7 105,2 °C-on izomerizált 55,5 41,6 0,3 2,6 14,1 8
