191858. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil plurilamelláris vesiculumok előállítására
III. táblázat 2 darab nőstény Swiss Webster egeret (kontrollcsoport) azonosan kezeltünk, azzal az eltéréssel, hogy lokálisan mindkét szembe radiojelzett gén- SPLV-kapszulázott gentamicin nyújtott kioldótamicin szulfát vizes oldatának egyenlő aliquot dása egész szemen történt lokális alkalmazás 1 191 858 mennyiségű 2 jzl-jét adagoltunk. A három csoportból álló kontroll állatokat 1,4 és 8 óra után megöltük. Az állatok leölése után a szemhéjakat azonnal eltávolítottuk, összevagdaltuk, és a fentiekben leírt eljárást alkalmazva extraháltuk, ily módon elválasztva a vizes komponenseket a lipid komponensektől. A fázisok radioaktivitását meghatároztuk, (a radioaktív beütések teljes számát visszaszámoltuk). A lipid fázisban mért radioaktivitás az SPLV lipidek retencióját mutatja a szemszövetben, míg a vizes fázisban mért radioaktivitás a gentamicin retencióját mutatja a szemszövetben. A 2. ábra grafikusan szemlélteti mindegyik komponens retencióját a szemhéj szövetében (az eredeti cpm szám %-ában kifejezve). A 2. ábra világosan szemlélteti az SPLV lipid komponensének a szemhéj szövetben való retencióját 24 órás periódus alatt, továbbá az SPLV- ből történő nyújtott gentamicin kioldódást 24 órás periódus alatt (a szemhéj szövetben ezen idő alatt visszamaradt gentamicin %-ában kifejezve. A 2. ábra a kapszulázatlan gentamicin (lokálisan adagolt vizes gentamicin) gyors eltávozását mutatja a szemhéj szövetből. így például a kontroll gentamicin oldat a szemszövetből 4 órán belül kiürült (a gentamicin mennyiségének kevesebb mint 5%-a maradt a szemhéj szövetben). Ugyanakkor az SPLV-kapszulázott gentamicinnak több mint 50%-a maradt vissza a szemszövetben ezen 4 órás periódus alatt; ténylegesen 24 óra elteltével az SPLV-kapszulázott gentamicin több mint 15%-a maradt vissza a szemhéjszövetben. Fenti eredmény azt mutatja, hogy az SPLV- kapszulázott gentamicin közel 85%-a 24 óra elteltével oldódott ki, míg a kapszulázatlan gentamicin szulfát 95%-a négyórás perióduson belül eltávozott. A 3. táblázat az SPLV lipid fázis: vizes fázis szemhéj szövet ben visszamaradt arányát hasonlítja össze mindegyik időpontban. Ennek az aránynak a növekedése a gentamicin SPLV-bői történő kioldódását jelzi. A szemhéj szövetben visszamaradt SPLV-kapszulázott gentamicin szulfát bioaktivitását szintén kiértékeltük. A gentamicin szulfátot az SPLV-kapszulázott gentamicin szulfáttal történt kezelés után három órával a szemhéj vizes fázisának extrakciójával nyertük vissza. A vizes fázisból hígííási sorozatot készítettünk, és abból 2 /ul aliquotot agar lemezen Staphylococcus aureus-al hoztunk össze; 24 órás inkubálás után a gátlási zónákat mértük. Az SPLV-kapszulázott gentamicin szulfáttal kezelt állatok szemhéjszöveteit extrahálva a gentamicin szulfátot visszanyertük és megállapítottuk, hogy annak bioaktivitása teljes mértékben megmaradt. 5 után Idő Utólagos kezelés A szemhéjból visszanyert teljes SPLV mennyiség a kezdő' dózis %-ában kifejezve A szemhéjban visszamaradt SPLV lipid: vizes fázis arány ('25 J-PE :125 J : GS 0 100% 1,55 1 óra 100% 2,1 3 óia 100% 2,82 18 óra 94 % 6,89 24 óra 85,1 % 7,17 20 Elektron spin rezonancia vizsgálatok Bár úgy tűnik, hogy az SPLV és az MLV elektromikroszkópos vizsgálattal azonosítható, az 25 ESR (elektron spin rezonancia) spektroszkópia nagyon pontosan megmutatja a szupramolekuláris szerkezetük közötti különbségeket. Az SPLV az MLV-tői a molekula felépítése alapján megkülönböztethető, bizonyítva a megnövekedő dett molekulapályát, a megnövekedett molekuláris mozgást és az aszkorbát nagyobb penetrabilitását. A molekula felépítése ezen eltérései meghatározzák a különböző biológiai hatásokat. Az elektron spin rezonancia spektroszkópos 35 vizsgálatok során spin szondaként 5-doxil-sztearátot (5DS) építettünk be a lipid kettős rétegbe. A doxilcsoport páratlan elektronja mikrohullámú energiát abszorbeál a mintának mágneses térbe helyezése során. Az abszorpciós spektrumból 40 három empirikus paraméter határozható meg: S, a pályaparaméter; A0 a hiperfinom kötési állandó, és a Tau a rotációs korrelációs idő. A 3. ábra tipikus jelet mutat, ahol A az SPLV jel, és B az MLV jel, mindkét esetben 5-doxil-sztearát jel- 45 zést alkalmazva. A spektrumot szobahőmérsékleten 100 Gauss scan range-n vettük fel. A pályaparaméteriek) melyek mind a 2Tt, mind a 2Tj j - tői függenek, a megfigyelt ESR jel eltérését mérik a teljesen egységesen orientált szondától. 50 Az egységesen orientált minta esetében S = 1,00, a rendezetlen minta esetében S értéke 0. A hiperfinom A0 kötési állandó a 2T, és 2Tj t értékéből számítható, és a lokális polaritás mutatja, mely érték a spin szonda helyzetét jelzi a 55 membránon belül. A rotációs korrelációs idő (mely a W0, h0, h-í értéktől függ) azt az időt jelenti, amely alatt a molekula „elfelejti” előző térbeli orientációját. A IV. táblázat 5-DS spin szondával ellátott SPLV és MLV jellegzetes ESR 60 eltéréseit mutatja. 8
