191858. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil plurilamelláris vesiculumok előállítására
1 191 858 Mint azt a fentiekben már leírtuk, az SPLV előállítása során valamely lipid et vagy azok keverékét szerves oldószerben oldunk, az oldathoz a kapszulázandó anyag vizes oldatát adjuk, és a keveréket ultrahanggal kezeljük. Az ultrahangos kezelés ideje alatt az oldószert előnyösen eltávolítjuk, a szerves oldószert azonban az ultrahangos kezelés alatt és után is bármely bepárlási technikával eltávolíthatjuk. A jelen találmányban ismertetett SPLV-t az alábbiak szerint állítjuk elő (bármely más módszer is felhasználható). Antibiotikum tartalmú SPLV előállítása 100 mg lecitint 5 ml dietil-éterben oldunk. A reakcióelegyet gömblombikba helyezzük. A lipid dietil-éteres oldatához ezután szobahőmérsékleten, 100 mg sztreptomicin szulfátot 5 mmól HEPES (4-[2-hidroxi-etil] piperazino 2-etán szulfonsav) 0,0725 mól NaCl/0,0725 mól KC1 pH = 7,4 értékű, 0,3 ml térfogatú oldatát adjuk. A reakcióelegyet ezután ultrahangos fürdőben (Laboratory Supplies Co., Inc.) (10536 típus) néhány percig (80 KkHz frekvencia: kimenő teljesítmény 80 Watt) emulgeáljuk és ezzel egyidőben nitrogéngáz átáramoltatással viszkózus pasztává szárítjuk. A visszamaradt viszkózus pasztához 10 ml 5 mmól-os HEPES-t adunk. A kapott SPLV készítményt, mely a sztreptomycint magába foglalja, puffer oldatban szuszpendáljuk, néhány percen át vortex keverőben rázzuk, és centrifugálással (12 000 x g, 10 perc, 20 °C) a nem kapszulázott sztreptomycint eltávolítjuk. A kapott lepényt 0,5 ml térfogatú 5 mmól-os HEPES-ben szuszpendáljuk. A dihidrosztreptomycin, vagy a gentamicinszulfát, vagy az ampicillin, vagy a tetraciklin-hidroklorid, vagy a kanamicin-tartalmú SPLV-ket a fentiek szerint eljárva állítjuk elő. Egyéb membrán összetevőket tartalmazó SPLV előállítása A fentiekben leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az alábbi anyagok valamelyikét tojás lecitinnel keverjük: 1. a foszfatidin sav 8:2 mólarányú lecitin: dicetil-foszfát összetételt eredményez; 2. a sztearil-amin 8:2 lecitin: sztrearilamin összetételt eredményez; a koleszterol és a sztearil-amin 7:2:1 lecitin:koleszterol:sztearilamin összetételt eredményez és 3. a foszfatidinsav és koleszterol 7:2:1 mólarányú lecitin: foszfatidinsav: koleszterol összetételt eredményez. Az SPLV előállítása Pilocarpine tartalmú SPLV előállítása A fentiekben leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy antibiotikum helyett pilocarpine-t alkalmazunk. SPLV előállítása BHT alkalmazásával és BHT alkalmazása nélkül Desztillálatlan éterbe tárolás céljából 1 pg/ml butil-hidroxi-toluolt (BHT) vezetünk. A fentiek szerint eljárva a desztillálatlan étert oldószerként használjuk a BHT SPLV készítménybe történő beépítéséhez. BHT-t nem tartalmazó SPLV-t a fentiekben leírtak szerint állítottuk elő, oly módon, hogy desztillált étert használunk oldószerként. Az SPLV hatóanyagleadása in vitro körülmények között. Az alábbiakban az SPLV által közvetített makrofágokba irányuló antibiotikum leadást mutatjuk be tenyészközegben. A peritoneális makrofágokat C57BLK felnőtt hím egereknél peritoneális átmosás útján állítottuk elő, majd a makrofágokat minimál alapközegben (M.E.M.) pH = 7,2 értéken 10% hő inaktivált szarvasmarha embrió szérum jelenlétében szuszpendáltuk. A sejt szuszpenziót 1 x 106 sejt/ ml koncentrációra állítottuk be szövetkultúrában. A peritoneális makrofágokat tartalmazó közeghez 1 x 106 CFU (colony forming units)/ml koncentrációban B. canis-t adtunk. 12 óra elteltével azokat a baktériumokat, melyeket a peritoneális makrofágok nem borítottak be, M.E.M.el történő ismételt mosással eltávolítottuk. A peritoneális makrofág tenyészet mosása után a közeget öt részre osztottuk, oly módon, hogy mindegyik csoport 12 replikát kultúrát tartalmazott. Az egyes csoportot kontrollként alkalmaztuk, melyet nem kezeltünk. A kettes csoporthoz 1 mg/ml koncentrációban vizes streptomycin szulfátot adtunk. A hármas csoporthoz puffer telített SPLV-t adtunk. A négyes csoport 1 mg/ml sztreptomycin szulfátot és puffer telített SPLV-t foglalt magába. Az ötös csoport 1 mg/ml sztreptomycin szulfátot tartalmazó SPLV-t képvisel. 24 óra után többszöri mosással a felülúszókat eltávolítottuk, és a peritoneális makrofágokat ismételt fagyasztással és felolvasztással szétzúztuk. A szétzúzott makrofágokból készített hígítás! sorozatot brucella agarra helyeztük, és 4 nap múlva a túlélő B. canis mennyiségét a hígítási sorozat alapján meghatároztuk. A kapott eredményeket a VII. táblázat mutatja, és látható, hogy az SPLV-be épített streptomycin in vitro körülmények között az intracelluláris B. canis fertőzéseket teljes mértékben megszünteti. A fenti kísérletet B. abortus esetében is elvégeztük, azzal az eltéréssel, hogy a peritoneális makrofágokat felnőtt nőstény albino tengerimalacokból peritoneális átmosással állítottuk elő. A kapott eredményeket a VII. táblázat foglalja össze. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
