191849. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászati hatású vegyületek és ezeket tartalmazó készítmények előállítására új hromobacterium violaceum törzs felhasználásával
15 191849 16 nás injekciók készítésénél a hatóanyagot pH-beállitó-, puffer-, stabilizáló-, izotoniásvagy helyi érzéstelenltó-anyagokkal keverjük el, majd a továbbiakban az ismert módszerek szerint járunk el. Orális készítmények előállításánál a hatóanyagokhoz kötőanyagot és kívánt esetben dezintegráló-, íz- és szagjavitó anyagokat adagolunk, majd a keveréket ismert módon tablettákká, bevonatos tablettákká, granulátumokká, porokká vagy kapszulákká alakítjuk. OráliB adagolási! folyadék-készítmények előállításánál a hatóanyaghoz íz- és szagjavitó-, puffer- és stabilizáló-anyagokat adagolunk, majd a keveréket ismert módon szirup vagy száraz szirup készítménnyé alakítjuk. Végbélkúpok készítésénél a hatóanyagot kötőanyagokkal és kívánt esetben felületaktív anyagokkal elkeverve, ismert módon alakítjuk kúpkészítményekké. Az Arphamenine dózisa a szimptomáktól függően változhat, felnőtt adagja általában 0,02-200 mg naponta. Ha más rákellenes vagy immunitást fokozó kemoterápiás szerrel együttesen kerül alkalmazásra, az Arphamenine-t a fenti mennyiségben kombináljuk az említett gyógyszerekre szokásosan előirt mennyiséggel. A találmány szerinti eljárást a következő .példákban részletesen ismertetjük, anélkül, hogy azt azokra korlátoznánk, mivel a példák alapján világosan ismertetett elóállitási és tisztítási eljárások bárki számára lehetővé tennék az eljárás módosítását. 1. példa Az Arphamenine-termelő Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 mikroorganizmus (régi deponálási szám FERM-p-6521, új deponálási szám: FERM-BP 286, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan) ferdetenyészetből kacsnyi mennyiséggel beoltjuk a 3% oldható keményítőt, 0,5% Prorich-t, 1,2% kukorica-sikér-lisztet és 0,2% kalcium-karbonátot tartalmazó tápközeget, majd azt 120 °C hőmérsékleten 20 percig sterilizáljuk és 110 ml-es mennyiségét 500 ml-es rázó lombikba helyezzük. A tenyésztést 27 °C hőmérsékleten 180 percenkénti fordulat mellett végezzük, figyelve a. képződő Arphamenine mennyiségét. Az Arphamenine-hozam 32 óra elteltével maximális. 36 óra után az Arphamenine koncentráció csökken (anti-aminopeptidáz B hatás alapján meghatározva). A tenyésztés alatt a tápközeg pH-értéke induláskor 7,4, 8 óra elteltével 7,8, 16 óra elteltével 7,6, 24 óra elteltével 7,85, 32 óra elteltével 8,1, 36 óra elteltével 8,1 és 52 óra elteltével 8,45. 2. példa A Chromobacterium violaceum BMG361-CF4 törzset az 1. példánál leírt tápközegben és az ott ismertetett módon tenyésztjük, majd 9,5 1 tenyészet pH-ját sósavval 2-es értékre beállítjuk, és leszivatással szűrjük (Hyflo Super Cell-en). Ily módon 9 liter szűrletet kapunk, amelynek aminopeptidáz B-gátló hatása (IC50): 0,05 ul/ml. 3. példa A 2. példa szerint nyert 9 liter tenyészetszűrlet pH értékét 5-re állítjuk be nátrium-hidroxid segítségével, majd 1 literes Amberlite XAD-4 töltetű oszlopon kromatografáljuk. Utána az oszlopot először vízzel mossuk, majd 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. A 2,3 liter aktív frakciót betöményitjük, csökkentett nyomáson szárítjuk. Ily módon 19,6 g nyers por-terméket kapunk, amelynek aminopeptidáz B-gátló hatása 0,2 ug/ml. Ezután a port megfelelő mennyiségű 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldatban oldjuk és 500 ml CM-Sephadex c-25-on kromatografáljuk. Ezután adszorbenst 1,5 liter 0,05 mólos nátrium-klorid oldattal és 1 liter 0,05 mólos citrát-pufferral (4,5 pH-ás) átmossuk, majd 2,5 liter fenti puffer-oldattal valamint 2,5 liter 0,55 mólnyi nátrium-kloridot is tartalmazó fenti puffer-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 18 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az Arphamenine A-t a 39-59. frakciók, az Arphamenine B-t a 60-89. frakciók tartalmazzák. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, Amberlite XAD-4- -gyel sótalanítjuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon az Arphamenine A frakciókból 188 mg nyers Arphamenine A port nyerünk, amelynek aminopeptidáz B-gátló hatása ICso: 0,0065 Mg/ml. Az Arphamenine B frakciókból 79 mg Arphamenine B por nyerhető, aminopeptidáz B-gátló hatása 0,0023 Mg/ml. 4. példa A 3. példa szerint előállított Arphamenine A port megfelelő mennyiségű 0,05 mólos vizes nátrium-klorid oldatban oldjuk és pH értékét 1 n sósavval 2,3-ra állítjuk be. Ezután az oldatot 80 ml-es CM-Sephadex C-25 töltetű oszlopon kromatografáljuk, majd 100 ml 0,07 mólos vizes nátrium-klorid oldattal átmossuk. Az eluálást 300 ml 0,07 mólos vizes nátrium-klorid oldattal átmossuk. Az eluálást 300 ml 0,07 mólos és 300 ml 0,5 mólos nátrium-klorid oldattal végezzük. Az eluátumot 8 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az Arphamenine A-t a 11-34. frakciók tartalmazzák. A 11-30. frakciókat összegyűjtjük, és pH értékét 1 n sósav oldattal 2,3-ra állítjuk be. Az így nyert anyagot Sephadex LH-20 töltetű 500 ml-es oszlopon kromatografáljuk, majd vízzel eluál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
