191849. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászati hatású vegyületek és ezeket tartalmazó készítmények előállítására új hromobacterium violaceum törzs felhasználásával
3 191849 4 A találmány tárgya eljárás új, gyógyászati Hatású anyag, az Arphamenine előállítására, új Chromobacterium violaceum BMG 361-CF4 mikroorganizmus törzsből való tenyésztés útján, valamint eljárás ezeket hatóanyagként tartalmazó immunitást fokozó és rákellenes gyógyszerkészítmények előállítására. Azt találtuk, hogy az Arphamenine, amely Arphamenine A-t és Arphamenine B-t, vagy ezek keverékét jelenti, se jtköz veti tett immunitást fokozó és rákellenes hatáBÚ anyag. Továbbá azt találtuk, hogy az Arphamenine különösen hatásosan gátolja az arginin-ß-naftilamid aminopeptidáz B-vel való lebontását. A találmány szerinti eljárással előállított új Arphamemine-t valamint sóit az (I) általános képlettel Írjuk le, amely képletben R jelentése Arphamenine A esetében hidrogénatom és Arphamenine B esetében hidroxilcsoport. Az Arphamenine A-t és B-t Arphamenine-t termelő baktériumok tenyésztésével, majd a tápközeg szűrésével és frakcionáláBával nyerjük, színtelen por formájában. A frakcionálást kromatografálással végezhetjük, például CM-Sephadex tölteten. A kapott frakciók tulajdonságai a következők: Arphamenine A: olvadáspont 117-119 °C, molekulasúly tömegspektrometriával meghatározva: 320; elemanaliziB C16H24N4O3.HCI ősszegképletű vegyületre: C=53,45%, H=7,11X, N=14,91X, 0=14,20X, C1=10,49X; UV spektrum W 257 nm (£ 180), 100 7/ml Arphamenine A tartalmú vizes oldatban mérve (abszorpciós görbe 1. ábra); IR spektrum (KBr) karakterisztikus sávjai: 3370, 3170, 2950, 1730, 1670, 1560, 1460, 1410, 1320, 1190, 1110, 760 és 710 cm*1 (abszorpciós görbe 2. ábra); W-NMR spektrum - (nehéz viz, é, 100 MHz): 2,04-2,33 (CHí), 2,35-2,72 (CH2), 3,34-3,69 (CHzx2), 3,69-3,84 (CH, CHz), 4,83 (CH), és 7,82-8,00 (CeHs) (abszorpciós spektrum 3. ábra). Arphamenine B: olvadáspont: 118°-120 °C; molekulasúly tömegspektrometriával meghatározva: 336; elemanalizis a Ci6H24N4O4.HCl.H2O ősszegképletű vegyületre: C=49,30X, H=6,88X, N=13,77X, 0=20,82X, C1=8,73X. UV spektrum Xau: 275 nm (£ 1040), és Xhx: 222 nm (£ 5500) 100 )/ml Arphamenine B tartalmú vizes oldatban mérve (abszorpciós spektrum 4. ábra); IR spektrum (KBr): karakterisztikus sávjai: 3370, 3180, 2960, 1730, 1670, 1560, 1520, 1460, 1420, 1330, 1250, 1180, 1110 és 840 cm'1 (abszorpciós görbe 5. ábra); NMR spektrum (nehéz víz, 5, 100 MHz): 1,87-2,30 (CH2), 2,30-2,62 (CH2), 3,14-3,54 (CH2x2), 3,54-3,78 (CH.CH2), 4,75 (CH), 7,30-7,67 (C6H4). A találmány szerinti eljárásban az Arphamenine-t termelő mikroorganizmus olyan mikroorganizmust jelent, amely képes Arphamenine A-t vagy Arphamenine B-t, vagy mindkettőt termelni. Ilyen mikroorganizmus törzsre példa a Chromobacterium violaceum BMG 361-CF4 törzs, amelyet a Poropinai-i Shikotsu tó (Hokkaido, Japán) partjának talajából izoláltunk, és a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan intézménynél 1982-ben, 6521 szám alatt helyeztünk letétbe (FERM P-6521). Ez a törzs újból deponálva lett FERM BP-286 letéti számon. A fenti mikroorganizmus törzs mikrobiológiai jellemzői a következők: (a) morfológiai jellemzők (1) sejt formája és mérete: pálcika; kb. 0,8-1,0 mikron x 2,0-4,0 mikron (2) pleomer fizmus: nem pleomorf (3) motilitás(flagelláció: motilis) poláris és laterális flagella (4) spóraképzödés: nem spórásodó (5) Gram-festés: negatív (6) savállóság: negativ (b) tenyészet jellemzői különböző közegekben (tenyésztés hőmérséklete 27 °C, 20 °C és 30 °C /csak húsleves-zselatin szúrt tenyészetnél/): (1) húsleves-agar lemeztenyészet: A képződő kolóniák kissé félgömb alakúak, széleik simák és köralakúak, a felület sima és fényes. A tenyésztés 17. órája után a kolóniák áttetszőek, majd fokozatosan opakká válnak és megjelenésük gumiszerü. A tenyésztés második napján színük bíborra változik, de diffundáló pigment nem képződik. (2) Húsleves-agar ferde tenyészet A kolóniák növekedése a beoltás mentén egyenletes. A felület sima és fényes, a szélek simák. A tenyésztés második napján a tápközeg alján színük bíborra változik, de oldható pigment nem figyelhető meg. (3) Húsleves folyékony tenyészet A tenyésztés második napján a tápközeg felszínén biborszlnű gyűrüalakú kolóniák képződnek. 40 óra elteltével az edény alján a törzs sejtek száma növekszik és színük a harmadik napon bíborra változik. (4) Húsleves-agar szúrt tenyészet 30 °C-os tenyésztési hőmérsékleten a sejtek a szúrás mentén növekednek, a tenyésztés harmadik napján a közeg elfolyósodik és az elfolyósodó rész csőalakú. 20 °C-os tenyésztési hőmérsékleten az elfolyósodás a hatodik napon figyelhető meg. (5) BCP tejtenyészet (Brom Cresol Purple-milk) A tenyésztés harmadik napján a BCP megkékül és a közeg koagulál. Az ötödik napon a koaguláció befejeződik és azonnali peptonizáció indul meg, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
