191746. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, a vér koleszterin szintjét csökkentő fehérjék és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 191.746 2 resztül hőkezeltük. b) A baktérium sejteket mostuk, fiziológiás sóoldatban szus/pendálluk és szonikusan, francia préssel és más szokványos módszerekkel szétroncsoltuk. 3) A zsír eltávolítása a sejtekből A szétválasztott sejtszuszpenziót kloroform-metanol 2:1 térfogatarány ü elegy ével kevertük össze. A szerves oldószerrel kié xii ah álható komponenseket teljesen eltávolítottuk 3.(XX) fordulat/perc sebességű 10 perces centrifugálással, majd a kloroformos fázist eldobtuk. 4) Proteolitikas enzimekkel való kezelés A zsírtalanított mintát olyan proteolitikus enzimekkel, mint a pronáz, tripszin és pepszin kezeltük szokványos eljárásokkal. Ezek közül a proteolitikus enzimek közül a pronáz a legalkalmasabb erre a célra. A kezelés körülményeinek leírását a Methods in Enzymology, VI11.kötet,26. old. (1966) tartalmazza. 5) Tisztítás A proteolitikus reakciókeverék felszínen úszó részéhez olyan kicsapószereket, mint a triklór-ecetsav vagy ammonium-szulfát, adunk, hogy kicsapjuk a fehéije frakciót. A fehérje-frakciót ezután a megfelelő nukleázokkal kezeltük, hogy eltávolítsuk az olyan nukleinsav alkotórészeket, mint a DNS és RNS a frakcióból. Az enzimes kezelések után az oldatot többször dializáltuk. A részleges tisztított fehérje-frakciót ezután további tisztítási eljárásoknak vetettük alá, mint például gélszűrés és ammónium-szulfáttal való frakdonálás, így végül egy tiszta fehérjefrakciót, amelyet CRP-nek neveztünk el, kaptunk. A CRP fehérje ál ta Iái osságban a fiziko-kémiai tulajdonságainak megfelelően, igen sok izolációs és tisztítási eljárással állítható elő, például kicsapás-kioldás és extrakció, oldószer extrakció, dialízis, oszlopkromatográfia, elektroforézis, gélszűrés vagy ezek kombinációja. Ezért a találmányunkat nem korlátozzuk egyetlen specifikus módszerre. A találmány szerinti eljárás rokonságban van más, fehérjékből felépülő, Streptococcus törzshöz tartozó mikroorganizmusok segítségével előállítható hipokoleszterolémikusan aktív termékek előállításával a proteüi frakció farniakológiai aktivitása miatt. Ezt részletesen a példákban mutatjuk be. A fennentlé felszínen úszó részének hipokoleszterolémiás aktivitása a baktérium sejtekben lévő anyagának egyötöde. A CRP fehérje fizikokérrúai tulajdonságai A találmány szerinti CRP fehéije fizikokémiai és fiziológiai tulajdonságai a következők: J. Kémiai jellemzők és oldékonysági tulajdonságok Az elporított minta, amelyet kisózás és fagyasztva szárítás után kaptunk, nem folyósodó fehér por vo't, amely acetonban oldódott, vízben igen jól oldódott. Amikor a CRP fehérje oldatát ammónium-szulfáttal vagy triklórecet-savval kevertük össze 4 °C-on, zavarosodást,illetve csapadék kiválást figyeltünk meg. 2. Mólsúly A találmány szerinti CRP fehérje mólsúlyát 30 000±7.000-re becsültük gélszűrés alapján Toyopearl HW 55 oszlopot (Toyosoda Co., Ltd.) melyet 0,3 mól nátrium-kloridot tartalmazó 25 milliinólos Tris-HCl pufferral, (pH=72) egyensúlyoztunk ki. 3. Izoelektroinos pont A CRP fehéije izoelektromos pontját izoelektromos fókuszáló módszerrel határoztuk meg 2% végső koncentrációjú Ampholine-t (pH=3,S-10, LKB Co., Ltd.) tartalmazó 5% poliakrilamid gélt használva 4 °C-on 200 V feszültséget alkalmazva 3 órán keresztül. 0,02 mólos foszforsavat és 1 mólos nátrium-klorid oldatot használtunk az anód, illetve a katód elektród oldataként. 100 pig mintát használtunk, mélyre Coomassie Brilliant Blue R-250-et cseppen tettünk. Az izoelektromos pont 7 ± 02 volt. Ez az érték a referencia anyaként használt patkány hemoglobinjának és az ámbráscet mioglobinjának izoelektromos pontja között volt. 4. Aminosav összetétel 1 mg mintát szuszpendáltunk 1 ml 6 n sósavban, ampullába helyeztünk, szárazjég-metanol keverékével fagyasztottuk meg, és a levegőt az ampullában nitrogén-gázzal helyettesítettük. A gázcserét háromszor hajtottuk végre, és az ampullát vákuum alatt lepecsételtük. 110 °C-on való 24 órás hidrolízis után a sósavat vákuum alatt rotációs evaporátor segítségével eltávolítottuk, és a mintát 200 jul 1/50 n sósav oldat ban oldottuk. Ezután ennek az oldatnak 50 jil-ét aminosav analizátorral (nagysebességű aminosav analizátor, 835. sz. modell, Hitachi Ltd.) vizsgáltuk meg. A CRP fehéije aminosav összetételét a 3. sz. táblázat tartalmazza. 3. TÁBLÁZAT Aminosav Mól % Glicin 25 23 Alanin 10.98 Glutamin 1024 Asz pa ragin 820 Lizin 629 Leucin 5 28 Valin 5,41 Izoleucin 5,18 Treonin 423 Ti rosin 4,19 Szerin 3,46 Prolin 2,62 Arginin 2,60 Penilalanin 226 Metionin 126 Hisz ti din 120 ősz fein 0,16 5. Az elektroforézis menete 25 CRP fehérjét korong elektroforetikus analízis segítségével vizsgáltunk poliakrilamid géleken (7% poliakrilamid) trisz-glicerin puffert (pH= 8,3) használva 4 mA/gél áramerősségnél 2,5 órán keresztül. Az anódtól 4,2 ± 02 cm távolságra a mintában lévő fehérje éles sávját figyeltük meg. A gél ábráját és az elektroforézis denzitometriás lefolyásának ábráját az 1. ábra szemlélteti. 6. Fiziológiai tulajdonságok A CRP fehéije emlősállatok vérének koleszterin szintjére csökkentő hatással van orális adagolás esetén. Ez az aktivitás — 80 - ♦ 115 °C hőmérséklet - és 4,1-10,9 közötti pH-tartományban stabil a CRP fehéije tárolása esetén. A CRP fehérje farmakológiái tulajdonságai 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
