191603. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai reagens és eljárás hidrofil latexrészecskéket tartalmazó szuszpenziók előállítására
191 603 12 arányban hígíljuk. 0,5 0,5 ml hígítótt szuszpcnzió-1)07, J00-I00 juin T4-szét um-szabvány-olda tot és 100-100 jum T4-/3-Gal konjugátum-oldatot adunk (a T4-szabvány-oldatok T4-tartalma különböző, de mindegyik ismert). Az elegyet szobahőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk állandó rázás közben, míg egy azonos T4-tartalmú kontroll-elegyet inkubálás közben állni hagyunk. Utána a szuszpenzíót centrifugáljuk és a szabad fázist tartalmazó szűrlclet elválasztjuk. A kötött fázis, azaz a solid-face-anti-antitestekhez kötött T4 -j3-Gal-konjugátum a csapadékban van. Az enzimaktivitás meghatározásához a csapadékot feleslegben vett szubsztrátumoldatban szuszpendáljuk. A szubsztrálumoldat összetétele az alábbi: 450 mg/( p-nitro-feniI-j3-ga!aktozid (gyártja: Sigma cég) 100 mmól nátrium-klorid 10 mmól magnézium-klorid 10 mmól trisz-puffer/HCl 0,4 tf% merkapto-etanol pH = 7,3. Az extjnkciót önmagában ismert módon, 405 nm hullámhosszon mérjük. A mechanikai keverés (rázás) nélkül lebegő állapotban tartott minta jele mintegy 11 %-kal gyengébb volt. Miután a fenti módon a T4 kalibrációs görbéjét meghatározzuk, ugyanezzel a módszerrel további meghatározásokat végeztünk, amelyekhez ismert T4- tartalmú etalonszérum helyett 100-100 jum ismeretlen T4-tartalmú mintákat használtunk. A kötött fázis extinkcióját szintén a csapadék szubsztrátumoldattal készített szuszpenziójában mértük. Megállapítottuk, hogy a hidrofil latexrészecskék kiválóan alkalmasak antitestek és antigének hordozójaként, az immunaktivitást nem csökkentik. Ezért a latexrészecskék solid-face enzim-immunotesztek során hordozóként igen előnyösen alkalmazhatók. Megállapítottuk továbbá, hogy a hidrofil latexrészecskck a pufferközegben hosszú időn keresztül lebegő állapotban maradnak, azaz sűrűségük megközelítően egy. Emellett a hidrofil latexrészecskék jól centrifugálhatok és újból szuszpenzióba vihetők anélkül, hogy az immunreaktivitás csökkenne. 11 15. példa Enzim-immuno-assay (EIA) emberi tireotropin (TSHj meghatározásához Az. emberi szérum TSH-szintjének meghatározása a pajzsmirigy megbetegedésének diagnosztikálásában nagy jelentőséggel bír. Elsődleges hipotireozis a bazális TSH-koncentráció erős emelkedésében (10— 100 juU TSH/ml) mutatkozik. Ugyanakkor a hipertireozist biztonsággal ki lehet zárni, ha a szérumban a TSH bazális értéke (0,5—3 juU/ml) TRH (Thyroideareleasing-hormon) beadása után nem emelkedik. Amennyiben a TSH-érték legalább 2,5 juU/ml értékkel, de 25 juU/ml-nél kisebb mértékkel emelkedik, a pajzsmirigy anyagcseréje nagy valószínűséggel zavartalan. Amennyiben a többé-kevésbé emelt bazális értéktől 25 juU/ml-nél nagyobb mértékben emelkedik a TSH-s/.int, rejlett preklinikus hipotireoz.isre lehet következtetni. A 'ISII meghatározására már i mertek enzim-immuno-assay-k (Clinica Chemica Acta 67, 263-268 (1976), Enzyme labelled immunoassay of hormones and drugs, szerkesztő: S. B. Pal, Walter de Gruyter, Berlin—New York, 1978. 327— 2- 370., o. Analytical Biochemistry 96,419 -425 /1979/). Az imsert meghatározási módszerek azonban igen hosszú inkubálási időt igényelnek (5 napig is terjedő időt), nem eléggé érzékenyek (5 juU/nil). vagy végrehajtásukhoz drága műszerek (fluorométer vagy luminométer), valamint az elegyek keveréséhez külön heverőberendezések szükségesek. A találmány szerint előállított hidrofil latexrészecskék alkalmazása lehetővé teszi a TSH fotometrikus meghatározását csupán 2 és 1/2 nap inkubá;ási idő után. A meghatározás a kettős antitest elvá’asztásának technikája szerint történik. Ennek során a második antitestet a hidrofil iatexrészecskékhez kötjük. A kötött enzim aktivitását a B/F-elválasztás után mérjük. A latexrészecskék — a vizétől alig különböző fajsúlyúk következtében — az enzimreakció alatt lebegő állapotban maradnak, a szokásos keverés tehát felesleges. Amennyiben igen hígított latexszuszpenziót használunk (és ez a részecskék magas kötési kapacitása miatt minden további nélkül lehetséges), az enzimreakció utáni centrifugálás is elhagyható, mert a fotometrikus mérés a híg szuszpenzión keresztül is elvégezhető. Az immunológiai tesztekhez szokásosan használt ismert latexek ellentétben a hidrofil, antitestekkel megrakott polimetil-metakrilát-részecskék centrifugálás után könnyen újból szuszpenzióba vihetők. Ugyanazon okból az enzimmel jelölt antigén nemfajlagos adszorpciója (kötött aktivitás primer antitest nélkül) igen csekély. A kísérlet végrehajtása 0,2 ml TSH-etalont (nemzetközi referencia készítmény MRC 68/38 TSH-mentes szérumban) ismert anti-TSH-antiszérum (pl. a tengerimalacé) vízzel vagy alkalmas puffernd készített 1:150 000 arányú hígításának 0,1 ml-jével együtt inkubálunk. 12 óra elteltével az elegyhez pipettával adunk glükózoxidázhoz kovalens kötéssel kötött 1,5X10 9 g TSH mennyiségnek megfelelő enzim-konjugátumot 0,1 ml oldatban. További 12 óra után 0,1 ml latexszuszpenziót adunk az elegyhez. A hozzáadott latexszuszpenzió 0,1-1 mg/ml metakrilát-latexet tartalmaz. A Iatexrészecskékhez előzőleg kovalens kötéssel (a 11. példában leírt módon) 1000 mg száraz latexre számítva 5 — 150 mg olyan proteint kötöttünk, amely kecske-antiszérumból tengerimalac-IgG ellen nyer immuno-globulin-frakcióból származott. Egy óra elteltével centrifugáljuk az egészet, és a csapadékot 1 ml alkalmas pufferoldatta! mossuk, amikoris a latexrészecskék újból szuszpenzióba mennek. A csapadékot még többször mossuk, a felülúszó részt kiöntjük. Mindegyik elegyhez a glükózoxidáz szubsztrátumá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
