191563. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lizozim enzim előállítására
19 í 563 2 A találmány tárgya új eljárás lizozim enzim előállítására tojásfehérjéből. Ismeretes, hogy a tojásfehérjében található lizozim erősen bázikus fehérje (izoelektromos pontja pH 10,5 és 11 közötti érték), molekulatömege 14 300. A lizozim fehér, kristályos por, amely vízben és híg pufferoldatokban jól oldódik, szerves oldószerekben gyakorlatilag oldhatatlan. Vizes oldata viszonylag hőálló, a fertőzési lehetőségek kizárásával 2—4 °C-on korlátlan ideig tárolható. A lizozim enzim antibakteriális hatása miatt a gyógyszeriparban elsősorban gyulladásgátló készítmények (például kenőcsök) hatóanyagaként, az élelmiszeriparban pedig élelmiszertartósítóként alkalmazható. Ezek a felhasználási területek nagy tisztaságú — legalább 25 000 Shugar egység/mg fajlagos aktivitású (Viszhim. Biophys. Acta 8, 303 (1952]) - enzimet igényelnek. A kívánt tisztaságú, kristályos enzim azonban csak bonyolult és költséges módszerekkel állítható elő, ami gátolja az enzim széles körű alkalmazását. Eddig már többféle módszert ismertettek lizozim elkülönítésére tojásfehérjékből. Valamennyi ismert eljárás közös kiindulási lépése az, hogy a sárgájától elválasztott fehérjeoldat pH-jának állításával az oldat viszkozitását csökkentik, és az oldatból eltávolítják a szilárd részeket (pl. a jégzsinórt). Az egyik ismert eljárásmód szerint (J. Biol. Chem. 157, 43 [1945]) az oldatot ezután az izoelektromos pont körüli pH-értékrc lúgosítják, és az enzimet nátriumklóriddal kisózzák. Az enzimet szobahőmérsékleten kristályosítással tisztítják. Az eljárás hátránya, hogy a kristályosítás hosszú időt (esetenként egy hetet) igényel, a kapott termék tisztasága nem kielégítő, és a melléktermékként képződő, legalább 5 % nátrium-kloridot tartalmazó fehérjeié semmire sem használható fel. A 2 248 843 és 2 248 804 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratokban ismertetett. többszöri ultraszűrést alkalmazó eljárások hoszszadalmasak és költséges készüléket igényelnek. További hátrányt jelent, hogy a szűrlet a tojásfehérje egyéb proteinkomponenseit sem tartalmazza. A konccntrátumbó! a lizozimot ebben az esetben is kisózással - 40 %-os ammónium-szulfát-oldat felhasználásával - csapják ki. Az ! 110 466 sz. nagy-briíanniai szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint a pH 6,5-re beállított tojásfehérje-oldathoz az oldat súlyának körülbelül 1/3-át kitevő mennyiségű gyengén savas ioncserélő gyantát (Amberlite IRC-50 gyantát) adnak, és az elegyet 0 és 5 °C közötti hőmérsékleten keverik. Miután a gyanta a lizozim zömét megkötötte, a gyantát elválasztják a fehérjeoldattól, a gyantáról 8 %-os ammónium-szulfát-oldattal leoldják a lizozimot, majd az eiuátumból további nmmónium-szulfát hozzáadásával kicsapják az enzimet. Az eljárás előnye az egyéb ismert módszerekhez viszonyítva az, hogy lehetővé teszi a tojásfehérjének a lizozimkinyerés utáni egyéb hasznosítását. Hátrányt jelent azonban, hogy 1 — a gyengén savas ioncserélő gyanta a lizozimon kívül a tojásfehérjében található egyéb bázikus jellegű anyagokat is megköti, a gyanta cluálásakor ezek az anyagok is lemosódnak, és szennyezik a kapott lizozimot; — a fehérjeoldathoz viszonylag nagy mennyiségű gyantát kell adni; — a gyanta eluálásakor híg enzimoldat képződik, amiből a lizozim viszonylag rossz hatásfokkal különíthető el; végül — a fehérjeoldatot 0 és 5 °C közötti hőmérsékleten kell a gyantával kezelni, ami energiaigényes művelet, A találmány célja a fenti hátrányok kiküszöbölésével olyan új eljárás kidolgozása, amellyel a tojásfehérjéből egyszerűen és jó hatásfokkal különíthető el nagy tisztaságú lizozim. ugyanakkor a lizozimkinyerés a tojásfehérjében lévő más értékes komponensek mennyiségét lényegében nem csökkenti, cs további felhasználásra alkalmas fehérjeoldatot szolgáltat. A találmány alapja az a felismerés, hogy a felületükön amidált, 25 (K)O-es átlagos kizárási molekulatömegnél kisebb pórusmérctű, gyengén savas kationcserélő gélek szelektíven képesek megkötni a tojásfehérje-oldatban lévő lizozimot. Ez a felismerés azért meglepő, mert eddig még nem volt ismert olyan anyag, amely több proteinkomponcnst tartalmazó fehérjeoldatból még az un, bekeveréses technika alkalmazásakor is gyakorlatilag csak egyetlen fehérjét képes szelektíven megkötni. A találmány alapja továbbá az a felismerés, hogy a fehérjeoldattól elkülönített és mosott gélről a lizozim viszonylag kis mennyiségű 4-15 súly/térfogat%-os vizes alkálifém-halogenid-oldattal Icoldhaíó. Ekkor tömény enzimoldatot kapunk, amiből a lizozim szobahőmérsékleten könnyen kristályosítható. A találmány szerint a pH = 6-8 értékűre beállított tojásfehérje-oldatot 25 000-cs átlagos kizárási molekulatömegnél kisebb pórusmérctű, felületén amidált, gyengén savas kationcserélő géllel hozzuk érintkezésbe, majd a fehérjeoldattól elválasztott gélt híg (legföljebb 1 súly/térfogat%-os) vizes alkálifém-halogenid-oldattal eluáljuk, és az eiuátumból önmagában ismert módon kikristályosítjuk a lizozim bázist vagy sóját. A találmány szerinti eljárásban kationcserélő gélként olyan, karboximelil-csoportokka! módosított cellulóz- vagy dextrángyöngyöket használunk fel, amelyek felületi karboxilcsoportjait előzetesen amidáltuk. A felületi amidálást úgy végezzük, hogy a duzzasztott gyöngyöket szerves oldószerben diszpergálva diciklohexil-karbodiimiddcl és ctanol-aminnal reagáltatjuk. Az említett géltípusok közül a CM-25 jelű ioncserélő gélek rendelkeznek a megfelelő (25 000-es átlagos kizárási molekulatömegnél kisebb) pórusmérettel. A felületi amidálás ugyan 10- 20 %-kaI csökkenti a gél ioncserélő kapacitását, de egyúttal biztosítja, hogy a gél pórusaiba be nem 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
