191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
5 .191 487 6 I. táblázat Baktérium törzsek Törzs Lényeges jellemzők Forrás vagy referencia E. coli HB101 recA~, HsdR, ItsdM, pro, leu,Strr 1 HB101 (pLAFRI) pLAFRl-t 2 tartalmaz HBIOI (pRK2013) pRK2013-t 3 tartalmaz BHB 2688 N205, recA, (kimmé34. cits, b2, red3, Eam4, Sam7)[k 4 BHB2690 N205, redA~, (Ximm434, clts, b2. 4 R. japonicum red3, DamI5, Sam7)jk 122 DES Hup + , USDA 122 származék 5 SR Hup + , Strr, Kanr, 122 DES származék 6 SRnal NaF SR származék 7 PJ17 Hup“, Str', Kanr, SR származék 8 PJ)7nal Nalr PJ17 származék 9 PJ18 Hup“, Strr, Kanr, SR származék 8 PJ 18nal Nalr PJ18 származék 10 1. Boyer, H. B., et al. (1969) J. Mol. Biol. 41, 459-472; ATCC 39195 és 39196-ből nyerhető. 2. Friedman, A. M., et al. (1982) Gene 18, 289-296. 3. Ditta, G., et. al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 7347-7351. 4. Hohn, B. (1979) Methods Enzymol. 68, 299-309. 5. Ruiz-Argüeso, T., et. al. (1979) Arch. Microbiol. 121, 199-207. 6. Maier, R. J., et. al. (1978) Nature 276, 494-495. 7. Cantrell. M. A., et al. (1982) nem közölt, csatolva. 8. Lepő, J. E., et. al. (1981) J. Bacteriol. 146. 614-620. 9. ATCC 39194 10. ATCC 39193 A fenti jegyzetben az összes írást referenciának tekintjük. Az ATCC 39193 és ATCC 39194 szám alatt deponált Rhizobium japonicum törzs morfológiai jellemzői: endospóra nélküli, általában pálcaalakú, mozgékony sejtek, poláris vagy szubpoláris flagellumok; aerob, gram negatív; sokféle szénhidrátot hasznosít; hüvelyesek gyökérzetén gümőképződést stimulál; élesztőextraktumot tartalmazó közegen lassan növekszik; köralakú, opak, ritkán átlátszó, fehér, konvex, textúrájukban szemcsés kolóniák, amelyeknek átmérője élesztői, mannitot, ásványi sókat tartalmazó agar táptalajon 5-7 napon át végzett tenyésztés után nem haladja meg az 1 mm-t ; előnyös szénforrás pentózok. Az ATCC 39195 és ATCC 39196 szám alatt deponált Escherichia coli törzs morfológiai jellemzői: kis gram negatív pálcikák; spórát nem képez; egyszerű táptalajon is könnyen növekszik; húsleves agar táptalajon sima, nedves, fényes felületű, ép szegélyű, szürke, nátrium-klorid-oldatban könnyen emulgeálható- (S) vagy durva, száraz, nátrium-klorid-oldatban rosszul emulgeálható (R) kolóniák; kemoorganotrof; kataláz pozitív, oxidáz negatív; nitrátokat nitritekké redukálja; egyedüli szénforrásként acetát igen, citrát nem használható; glükózt és más szénhidrátokat savvá alakít. Kozmid DNS E. co/i-ból és R. japonicum-bó\ nagymennyiségben való előállítását Cantrell, Hickok és Evens módszerével végezzük [Arch. Microbiol 131. 103- 106 (1982)]. Génbank készítésére való felhasználás céljából Az E. coli-ból származó pLAFRI DNS- t tovább tisztítjuk kétszeri cézium-klorid/etidiumbromidos gradiens centrifugálással, 49 súlyszázalék cézium-kloridot és 0,35 mg/ml etidium-bromidot tartalmazó 50 mM Tris-CHl, 20 mM EDTA, pH8, (TE púder) összetételű pufTerbcn. A gradiens oldat kezdeti törésmutatója 1,3910. Az oldatokat Beckmann VTÍ65 rotorban egyensúlyi állapotig centrifugáljuk (12- 16 óra, 55 000 ford/perc). A kovalensen kör formába záródott, a második gradiens-centrifugálás után kinyert DNS TE púderrel hígítjuk és centrifugálással Beckmenn SW 60 rotorban kicsapjuk. A kicsapott DNS-t 0,37 ml, 6 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM nátrium-klorid, 0,1 mM EDTA összetételű púderben (DNS-tároló púder) oldjuk, többször extraliáljuk izoamil-alkohollal és etanoilal kicsapjuk. A csapadékot csökkentett nyomáson szobahőmérsékleten szárítjuk, majd újra oldjuk, majd tároljuk 0,25 ml DNS tároló púderben. Restrikciós elemzés céljára kismennyiségű kozmid DNS-t E. coli-ból a tisztított lizátum technikával állítunk elő [Kahn, M., Kolter, R., THomas, C., Figurski, D., Meyer, R., Remant, E. and Helinski, D. R. Methods in Enzymol.. 68, 271 —272 (1979). össz-kromoszómális DNS-t 500 ml R. japonicum tenyészetből állítunk elő, melyet HUM-táptalajban növesztünk, 540 nm-en mért körülbelül 1.0 optikai sűrűségig az előzőleg leírt módszernek [Haugland, R. A., and Verma, D. P. S. J. Mol. Appl. Genet. 1, 205-217 (1981)] a következő módosításával. Miután a felcsavart, etanoilal kicsapott DNS-t megszárítottuk, újra feloldjuk 5 ml, 150 mM nátrium-klorid és 15 mM nátrium-citrát összetételű, pH 7.0 oldatban (I x SSC). Ugyanebben a púderben 1 mg/ml RNázA-t 15 percig 80 °C-on tartunk, majd 50 pg/ml végkoncentrációban a DNS oldathoz adjuk. 30 percig 37 ”C- on inkubáljuk, majd a DNS-t ismét felcsavarjuk két térfogat etanol felülrétegzése után, majd a fentiek szerint újra kezeljük. B. Beépített DNS/vek tor DNS rekombinánsok készítése Az R. japonicum DNS-t, melyet beépítendő DNS- ként (HU DNS) használunk, Eco RÍ restrikciós enzimmel emésztünk, majd a következő eljárás szerint méret alapján szétválasztunk. R. japonicum 122 DES össz- DNS-t (200 pg) 37 °C-on inkubálunk 20 pl fcoRI 5 19 15 2D 25 3D 35 49 45 5D 55 60 65 4
