191397. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagok előállítására hibrid sejtvonal tenyésztésével
1 191 397 2 A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy biológiailag aktív, gyógyászatban használható anyag előállítására képes e.mberí makrofág sejtvonal és timidinkináz-hiányos emberi tumor makrofág sejtvonal fúziójával létrejött, szaporodásra képes hibrid sejtvonalat használjuk a biológiailag aktív anyag előállítására. Számos közlemény ismert olyan próbálkozásokról, melyek során emberi makrofágok segítségével próbáltak a gyógyászatban használható, biológiailag aktív anyagokat előállítani. Azonban jelenleg az egyetlen ígéretes mód ilyen biológiailag aktív anyag előállítására gyakorlatilag használható mennyiségben az, ha daganatos betegből állítunk elő sejtvonalat. Daganatos betegből létrehozott emberi tumor makrofág sejtvonalak közé tartozik az U-937 [International Journal of Cancer, 17, 565-577 (1976)], THP-1 [International Journal of Cancer, 26., 171-176(1980)] J-lll [Blood, 10, 1010(1955)],HL-60lNature, 270, 347 (1977)], KG-1 [Science, 200, 1153)] és K-562 [Blood, 45, 321-334 (1975)]. Hivatkozva azokról a kísérletekről megjelent közleményekre, melyekben megpróbáltak biológiailag aktív anyagokat nyerni ezekből a sejtvonalakból, megemlíthetjük a S. B. Mizel és munkatársai [Interleukins, Lymphokines, and Cytokines, Academic Press, Inc., 401-407 (1983)] és T. Krakauer és munkatársai [Cellular Immunology, 80, 223-229 (1983)] által ajánlott módszereket interleukin-1 előállítására THP-l-ből, az R. Palacios és munkatársai [European Journal of Immunology, 78, 368-374 (1983)] által javasolt módszereket interleukin-1 előállítására U-937-ből; és az R. H. Butler és munkatársai [Cellular Immunology, 78, 368-374 (1983)], által javasolt módszereket interleukin-1 előállítására CM-S-bői. E. V. Gaffney és munkatársai például [Cancer Research, 43, 3668- -3673 (1983)] leírnak egy THP-1-et alkalmazó módszert tumorellenes faktorok előállítására. Daganatos betegekből izolált emberi makrofág sejtvonalakat lipopoliszachariddal, növényi lektinnel vagy limfociták által kiválasztott anyagokkal serkenthetünk különböző biológiailag aktív anyagok kiválasztására [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 5379-5383 (1982)]. Azonban mivel ezeknek az anyagoknak a mennyisége igen csekély és a sejtvonalak fajtái lényegében csak a fentiek lehetnek, ezeknek a technikáknak kicsi a gyakorlati alkalmazhatóságuk. Számos módszert goi idol lia lünk ki, hogy az emberi makrofágokat szaporodóképessé tegyük, úgymint amikor a sejteket tumorsejtekké alakítjuk egy vírussal vagy kémiai karcinogénnel, az a módszer, melyben a kívánt sejteket sorozatosan átoltott sejtek közül választjuk ki és a például tumor-sejtekkel való fúziót alkalmazó módszer. Ezen és más módszerek közül a sejtfúziós technika a legalkalmasabb, amennyiben ha egyszer kidolgoztuk, a technika nagyon különböző sejtekre alkalmazható, és a karcinogén kémiai maradékok problémáját elháríthatjuk. Ami a makrofdgok fúzióján a múltban végzett munkát illeti, például A. H. Warfel [Experimentaland Molecular Pathology 28, 163-176 (1978)], valamint Sone és munkatársai [American Journal of Pathology, 103 (2), 234-246 (1981)] közölték, hogy néhány állat, például egér, patkány és nyúl homológ sejtjeinek fúziójakor óriás-sejtek keletkeznek. Ami a különböző sejtek közötti fúziót illeti, az egyetlen elérhető közlemény [P. Stahl et al., The Journal of Cell Biology, 93, 49-56 (1981)] patkány és egér makrofágok fúzióját írja le, és nem ismert emberi makrofágok sikeres fúzióját leíró közlemény. Humán makrófágból származó daganatos sejtvonal és ncm-dagaualos humán makrofág sejtek fúziójának lehetőségét vizsgáltuk, és sikeres fúziós technikát fejlesztettünk ki azzal, hogy a szokásos eljárást polietilén-glikol, mint fúzionáltató szer használatával megjavítottuk. Ennek eredményeképpen kívánt biológiailag aktív anyag vagy anyagok előállítására alkalmas eljárást fejlesztettünk ki. A találmány tárgya eljárás tumorgátló hatású anyag vagy interleukin-1 előállítására sejtvonal tenyésztésével, majd a termék izolálásával, azzal jellemezve, hogy a tenyésztés során sejtvonalként timidin-kináz hiányos emberi daganatos makrofág sejtvonal és a tárgyi körben jelzett anyagokat termelő emberi nem-daganatos makrofág polictilén-glikol jelenlétében végzett fúziójával kapott lúbrid sejtvonalat alkalmazunk. A felhasználható emberi daganatos makrofág sejtvonal előnyösen az U-937 timidin-kináz hiányos sejtvonal, vagy a TliP-t timidin-kináz hiányos sejtvonal, a sejtvonal stabilitása, valamint a sejtfúziós eljárás könnyűsége szempontjából. Az emberi nem-daganatos makrofág lehet különböző szervekből származó makrofág, perifériális vér monocita, stb. A szokásos sejtfúziós technikát polietilén-glikol használatával megjavítva úgy találtuk, hogy a fúzió hatásossága megnövelhető, és ennek következtében az eddig ismert technológiával lehetetlen emberi makrofág sejtek közötti fúzió végrehajtható, ezáltal lehetővé válik emberi eredetű, gyógyászatilag hasznos, biológiailag aktív anyag előállítása gyakorlatban hasznosítható mennyiségben. A jelen találmány alapján eliminálható az antigenicitás problémája, mely akkor jelentkezik, ha nem-emberi eredetű anyagot adunk be embernek, ennek eredményeképpen a találmány nagyon hasznos eszközt szolgáltat gyógyászatilag hatásos, a rák, immun-betegségek, trombózis stb. kezelésében értékes anyagok előállítására. A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív anyag előállítására, azzal jellemezve, hogy emberi daganatos makrofág scjtvonaíat emberi nem-daganatos makrofágokkal fúzionáltatva kapott hibrid sejtet használunk. Bármely ismert sejtvonal, például U-937, THP-1, J-lll, HL-60 és K-562 használható emberi daganatos makrofág sejtvonalként. Ezek az emberi daganatos makrofág sejtvonalak a fenti irodalmi hivatkozások szerzőitől beszerezhetők. Továbbá az U-937 sejtvonal az Amerikai Típus Tenyészet Gyűjteményében van letétbe helyezve, CRL-1593 szám alatt. Azonban a sejtvonalak stabilitása és a fúziós eljárás könnyűsége szempontjából (a Dotációval kapcsolatban) az U-937 és THP-1 sejtvonalak használhatók előnyösen. A jelen találmány céljaira más sejtvonalak is használhatók, mivel a különböző sejtvonalak használatával kapott hibrid sejtek különböző tulajdonságokkal rendelkeznek. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
