191303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a baromfiak fertőző gége-légcső-gyulladása elleni vaccina előállítására
1 191 30: . 2 A fertőző gége-légcsőgyulladás (rövidítve ILI) a baromfiak vírus által okozott, heveny lefolyású betegsége. A betegség meglehetősen elterjedt külföldön és hazánkban is. A természetes fertőzés gyakorlatilag minden esetben a légutakon keresztül következik be. Az átlagos lappangási idő természetes fertőződés esetén 8 nap. A betegség a vírus behurcolása után gyorsan terjed, rendszerint valamennyi állat megbetegszik. A taraj és a fej cjanotikus, az állat belélegzéskor magasra tartja a fejét, kilélegzéskor pedig lehajtja. Idült esetekben a kötőhártyás fibrines felrakodás látható és a szemhéjak kötőszövetes megvastagodása miatt ún. mandulaszem kialakulása figyelhető meg. A beteg állományokban lényegesen csökken a tojáshozam. Boncoláskor a legsúlyosabb elváltozások a légcső felső harmadában találhatók. A vérömléscs nyálkahártyát véres nyálka fedi. A nyúlós váladék esetenként teljesen elzárja a légcső lumenét. Néha a gyulladás vérzéses jellege hiányzik. A légcsőben sárgás-sajtos fibrines anyag, esetleg pergamenszerű száraz álhártya található. Az előzőekben leírt betegség ellen az állományokat védőoltásban kell részesíteni, s ilyen oltóanyag elkészítésére kiválóan alkalmas az általunk izolált, és az OKl-nál letétbe helyezett 1LT-81 jelű törzs. A nagyüzemi baromfiállományok védőoltásához gyenge virulenciájú vírustörzsből készült, élő vírust tartalmazó vakcinákat használnak,.leghatásosabban a szem kötőhártyájára cseppentéses módszerrel, két hónapos korban. Egy ilyen vakcina készítését például a 3 331 736 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. Az élővírust tartalmazó vakcinák azonban a fiatalabb baromfiakban kedvezőtlen megbetegedéseket és a súlygyarapodás csökkenését eredményezik. Kívánatos volna tehát elölt (inaktivált) vírusos vakcinát készíteni, amely ugyanolyan hatékony, mint az élővírusos vakcinák. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a fertőző gége-légcsőgyulladás ellen megfelelő immunitást biztosító, inaktivált vakcina az OKI-nál MNG 00278 szám alatt letétbe helyezett JLT-81 jelű törzs felhasználásával állítható elő. A találmány értelmében 9 12 napig, előnyösen 10 napig clőkcllctctt tojásokat az ILT-81 vírussal beoltunk, az oltástól számított 2. és 5. nap közötti időben, előnyösen a 4. és 5. napon elpusztult, illetve elölt embriók chorioallantois membránját (CAM) összegyűjtjük, homogenizáljuk, pH- értékét 5,8 és 8,2 közötti,-előnyösen 7,2 és.7,4i.közötti értékre állítjuk, inaktiválószerrel, előnyösen etilén-iminnei. /3-propiolaktonnal vagy formaldehiddel inaktiváljuk, majd depot hatású adjuvánst, előnyösen ásványi olajat vagy alumíniumhidroxid-gélt adunk hozzá. A fentiek szerint előállított inaktivált vakcina az eddig alkalmazott élővírusos vakcinával egyenértékű védettséget nyújt az oltott állatoknak. A kapott vakcinát a bevezetőben részletezett kórképek megelőzésére, illetve az állatok immunizálására használjuk fel. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg. A példákban használt rövidítések: CAM chorioallantoisz membrán EID50 50%-os effektiv fertőzést előidéző dózis 1. példa A vakema termeléséhez 10 napos embrionált SPF tojásokat használunk fel, amelyek legalább 50—55 g súlyúak és világos héjúak. Az előkeltetett tojásokat fertőzés előtt lámpázzuk, majd megjelöljük a légkamra .határát és a CAM legszélesebb tapadási részének közepét, utána a tojásokat fertőtlenítjük, és a megjelölt CAM résznél kifúrjuk. Ezután a tojásokat tompa végüknél kilyukasztjuk, utána a héjhártya és a CAM közé egy-egy csepp antibiotikum tartalmú foszfátpuffer oldatot juttatunk. A tojásoltó vírust foszfátpufferrel hígítjuk úgy, hogy az inokulum mennyisége 100 ElDso/0,2 ml legyen tojásonként. A tojáshéjon keletkező nyílásokat paraffinnal zárjuk és a tojásokat 37 °C-os keltetőbe helyezzük. Az embriókat további 5 napig keltetjük. Az oltott tojásokat a 72. óra után lámpázzuk és az addig elhullottakat megsemmisítjük. A 4. és 5. napon elhullottakat a vírus aratásáig +4 °C-on tartjuk. Az 5. napon még élőket hűtéssel elöljük. A vakcina készítéséhez így a 4. és 5. napon elpusztult, illetőleg hűtéssel elölt embriók CAM-ját használjuk fel. A virus aratásakor a tojásokat fertőtlenített tálcákra. helyezzük és a légkamra feletti tojáshéjat fertőtlenítés után steril fülkében eltávolítjuk. Az embrió és a szikhólyag kiöntése után a tojáshéj belső felületére tapadt, megvastagodott membránokat steril csipesz segítségével kb. 100 g onként összegyűjtjük. A learatott membránokat 600 /rg/ml uátrimnaziddal konzerváljuk, majd 4—5 percig finom péppé turmixoljuk 4—5 percen át Jensen-pufferrel fele-fele arányban hígítva. Ezután az anyagot 2800-3000 g értékkel forgatható, hűthető centrifugában fél órán keresztül centrifugáljuk, utána a felülúszót leöntjük, és +4 °C-on tároljuk. A centrifugálás után nyert üledéket Jensen pufferrel eredeti. térfogatára felöntjük, ismét turmixoljuk, majd centrifugáljuk. Az első és második centrifugálás után nyert felülúszókat egységesítjük és 10—15 literes üvegekben +4 °C-on tároljuk. Üvegenként mintát veszünk a sterilitási és vírustitrálási vizsgálatokhoz. Inaktiválás előtt legalább 106 EID/0,2 ml vírust kell tartalmaznia a szuszpenziónak. A vírusszuszpenziót inaktiválásig hűtőszobában legfeljebb 1 hétig tároljuk. Az ILT vírus inaktiválását 1200 jug/ml etilén-iminnel 24 órán keresztül 37 °C-on történő kezeléssel végezzük. Az inaktiválás eredményességét tojásoltással ellenőrizzük. A bakteriológiai fertőzöttséget a VI. Magyar Gyógyszerkönyv előírásai szerint vizsgáljuk. Az inakti- ' vált és steril antigént azonos mennyiségben inkomplett olajadjuvánssal keverjük és homogenizáljuk. A kapott , vakcinát +4 °C-on tároljuk. Az oltóanyag lejárati ideje ilyen tárolás mellett 1 év. 2. példa Az 1. példában leírt módon előállított virusszuszpenziót 1000 jug/ml formaldehiddel inaktiváljuk 24 órán keresztül 37 °C-on történő kezeléssel. Az inaktiválás eredményességét tojásoltással ellen5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 2
