191292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribavirin előállítására
23 12. táblázat folytatása 191 292 24 Ribavirin Mikroorganizmustörzsek kitermelés (*) Enterobacter aerogenes IFO 12 010 1 14,34 Enterobacter cloacae ATCC 7256 10,42 Vibrio anguillarum IFO 13 266 19,76 Erwinia carotovora subsp. carotovora IFO 12 380 41,99 Klebsiella pneumoniae ATCC 8308 9,69 14. példa A 13. táblázatban megadott mikroorganizmustörzsek mindegyikét 50-50 ml porított húsleves 2 %-os vizes oldatába oltjuk, ée rázással 24 óra hosszat 28 °C hőmérsékleten tenyésztjük, majd a sejteket eltávolítjuk, és mindegyik sejthez annyi vizet adunk, hogy mindegyikből 5 ml-es sejtszuszpenziót kapjunk. Az előbbi 5 ml-es sejtszuszpenziók mindegyikéhez 10-10 ml vizes oldatot (pH = 7,0) adunk, mely 20 mmól 1,2,4-triazo!-3-karboxamidot és 25 mmól monokálium dihidrogén-foszfátot tartalmaz, és a reakciót 24 óra alatt 45 °C hőmérsékleten lefolytatjuk. A reakció befejezése után a sejteket centrifugálással eltávolítjuk, és a ribavirin kitermelését analízissel meghatározzuk. Az eredményeket a 13. táblázat mutatja. A fizikai állandók azonosak az 1. példáná) megadott értékkel. 13. táblázat Ribavirin Mikroorganizmus-törzs kitermelés (%) Brevibacterium acetylicum AT-6-7 FERM P - 6305 (ATTC 39 311) 24,52 Brevibacterium imperiale ATCC 8365 2,00 Corynebacterium equi IÁM 1038 10,40 Bacillus subtilis ATCC 14 593 2,25 Micrococcus variáns IFO 3765 1,83 15. példa 5 liter 1,5 %-os élesztőextrakt táptalajba (pH-7,5) 250 ml Brevibacterium acetylicum AT — 6 — 7 (FERM P-6305, ATCC 39 311) előtenyészetét oltjuk és a tenyésztést 24 óra alatt 28 °C hőmérsékleten lefolytatjuk. A táptalajból a míkrobás sejteket centrifugálással eltávolítjuk és 500 ml sejtszuszpenzióra beállítjuk. 500 ml vizes oldathoz (pH = 7,0), mely 20 mmól 1.2,4triazol-3-karboxamidot és 25 ml mmól monokáliure-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, 500 ml előbbi sejtszuszpenziót hozzáadjuk és a reakciót 24 óra alatt 45 'C hőmérsékleten lefolytatjuk. A rcakcióelegybcn a ribavirin kitermelése 24,38 %. A mikrobás sejtek eltávolítása után az oldatot az át nem alakult l,2,4-triazo!-3-karboxamid eltávolítására, kationcserélő gyantával (H 1 forma) kezeljük, rr.ajd a ribavirint a kezelt oldatból aktív szénen adszorbeáljuk. A ribavirint ezután 2 % ammóniát tartalmazó 50 %-os etil-alkohol oldattal eluáljuk, az etanolt ledesztilláljuk, és a visszamaradt oldatot anioncserélő gyantán (bázis forma) átengedjük. Az átfolyt oldatot betöményítjük, így 475 mg kristályos ribavirint kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak az 1. példában megadottakkal. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás ribavirin előállítására, amelynél 1,2.,4-triazol-3-karboxamidol vagy sóját és ribóz donort cnzimforrással érintkeztetünk, amely olyan enzimet tartalmaz, amely l,2,4-triazol-3-karboxamidból és ribóz donorból a ribavirin képződést katalizálja, azzal jellemezve, hogy enzimforrásként a ribóz donor és 1,2,4- tviazol-3-karboxamid reakciójának katalizálására vizes közegben Brevibacterium, Cornynebacterium, Arthrobacter, Micrococcus vagy Bacillus nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok tenyészetét, intakt sejtjeit vagy módosított sejtjeit alkalmazzuk a mikroorganizmusok nem szaporodó körülményei között és a képződött ribavirint a reakcióközegből kinyerjük, (Elsőbbsége: 1982. április 30.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ribóz donorként ribonukleozidokat, D-ribózt vagy ezek foszforsav-észterét alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1982. április 30.) 3. Az igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Brevibacterium acetylicum AT-6-7 (ATCC 39 311) mikroorganizmus törzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1982. április 30.) 4. Eljárás ribavirin előállítására, amelynél 1,2,4-triazol-3-karboxamidot vagy sóját és ribóz donort en- 7Ímfoi rással érintkeztetünk, amely olyan enzimet tartalmaz, amely az. l,2,4-lriazol-3-karboxamidból és a ribóz donorból a ribavirin képződését katalizálja, azzal jellemezve, hogy enzimforrásként a ribóz donor és rz l,2,4-triazol-3-karboxamid reakciójának katalizá- I ísára vizes közegben Flavobacterium, Microbacterium (Brochotrix), Xanthomonas, Pseudomonas (Alteromonas), Achromobacter, Escherichia, Aerobacter, íiarcina, Staphylococcus, Bacterium, Serratia, Proteus, Cellulomonas, Enterobacter, Mycoplana, Vibrio, Erwinia, Klebsiella, Aeromonas, Mycotorula vagy Candida nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok tenyészetét, intakt sejtjeit vagy módosított sejtjeit alkalmazzuk a mikroorganizmusok nem-szaporodó körülményei között és a képződött ribavirint a reakcióközcgböl kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982. június 11.) 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
