191292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribavirin előállítására
1 191 292 2 A jelen találmány tárgya ribavirin előállítása új enzimatikus eljárással. A ribavirin kémiai nómenklatúra szerint 1-/Î-D- ribofuranozil-l,2,4-triazol-3-karboxamid, melyet virazolnak is neveznek (márkanév), és olyan vegyülelként ismert, mely DNS és RNS vírusokkal szemben szélesspeklrumú és erős vírusellenes aktivitással rendelkezik. [Annalsof the New York Academy of Sciences 284, 212-292 (1977).] 43 435- 1818 A ribavirin előállítására olyan eljárások ismertek, melyek szintetikus, fermentativ és enzimatikus módszerek közé sorolhatók. Az ismert, reprezentatív szintetikus módszerek magukba foglalják azokat az eljárásokat, melyekben 3- metoxi-karboni!-l,2,4-triazoll !-0-acetil-2,3,5-tri-0- acil-/?-D-ribofuranozokkal reagájtatnak, a kapott 1 - (2',3',5' - tri- O - acil - ß - D - ribofuranozil) - 3 - metoxi - karbonil - 1,2,4 - triazolt amidálás céljából ammóniával kezelik, majd a védőcsoportot eltávolítják (lásd 4469/1973, 80 070/1974 és 80 071/1974 számú japán nyiivánosságrahozatali iratokat]; ehhez a módszerhez hasonlóan azt az eljárást, melyben a triazolgyűrű 3-helyzetben aralkjl-oxi-szubsztituenst alkalmaznak [lásd 160 793/1980 számú japán nyiivánosságrahozatali iratot]; azt az eljárást, melyben 3- metoxi-karbonil-l,2,4-triazolt trimetil-szilileznek és ezt 3,4,5-lri-0-bcnzoil-/J-D-ribofuranoz halogenidjcvel reagáltatják, majd ammóniával kezelik [lásd 4469/ 1973 és 86 372/1974 számú japán nyilvánosságrahozatali iratokat]; és még más eljárásokat. Ezen szintetikus módszerek bármelyikében szükséges a kiindulási vegyületek aktiv csoportjainak megvédése a reakció előtt, vagy a reakció lefolytatásában néha kívánatos lehet a ribóz aktiválása, ilyen esetekben magasabb hőmérsékletre történő melegítés is szükséges. Továbbá, a reakció után védöcsoport-eltávolítás és amidálás végrehajtása szükséges, ami nehézkes reakcióműveletek problémáit hozza magával. Egy másik probléma az, hogy a kondenzálási reakcióban a helyzeti szelektivitás, megítélésünk szerint, ezeknél a módszereknél nem magas. A korábban ismert fermentativ eljárásokban az l,2,4-tríazol-3-karboxamidot egyszerre vagy részletekben adják az alkalmazott mikroorganizmusok tenyésztéséhez szükséges szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen anyagokat és más tápanyagokat tartalmazó tenyészközeghez, mégpedig a Brevibacterium, a Corinebacterium, az Arthrobacter, a Micrococcus vagy a bacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok tenyésztésének megkezdése előtt, vagy a tenyésztés közben, és a tenyésztést 2-4 napon át végzik, miáltal a tenyészközegben ribavirin képződik és felszaporodik [lásd a 17 830/1979 számú japán nyiivánosságrahozatali iratot; Journal of the Agricultural Chemical Society oí japan, 50 (9), 423-430 (1976)]. Ez a módszer a következő problémákat rejti magában : (1) mivel a ribavirin termelését tápközegben, a mikroorganizmusok szaporodása közben végzik, ezért előbb a mikroorganizmusok szaporodásához különböző tápanyagforrást tartalmazó tenyészközeget szükséges elkészíteni, ezenkívül nehézkes előkezelésre is szükség van, mint amilyep a tenyészközeg sterilizálása az oltómikroorganizmijssal történő beoltás előtt; (2) ribarivin termeléséhez a tenyésztést, melyet mikroorganizmusok elszaporodása kísér, általában 20-40 °C közötti normát hőmérsékleten folytatják le, és ezért állandó ellenőrzés szükséges a különböző mikroorganizmusokkal való fertőzés miatt. Ezen túlmenően, ilyen körülmények között, a ribavirin elbom? lásának lehetősége is fennáll, és ezzel a vegyület kitermelése is csökken ; (3) a mikroorganizmus szaporítását hosszabb ideig, 2-8 napon át kell végezni; (4) a ribavirin különböző nukleozidjai, foszforílezett termékei, és mint melléktermékek, más metaboli tok képződnek, következésképpen, a ribavirin tenyészközegből való kinyerése megköveteli azt, hogy a ribavirint ne csak a kiindulási vcgyületckből, hanem a különböző melléktermékektől is elválasszák, ami viszont a kinyerést és a tisztítást nehézkessé teszi; és (5) a mikroorganizmust a ribavirin termelésének egész ideje alatt tenyészteni keli. Az ismert enzimatikus módszerek abból állnak, hogy az l,2,4-triazol-3-karboxamidot ribóz-t-foszfáttal reagáltatják 5 - 9 pH-n cs 0 - 50 °C közötti hőmérsékleten nukleozid-foszforiíázok jelenlétében n9 720/ 1075 számú japán nyiivánosságrahozatali irat]. A módszernek az lehet a problémája, hogy a ribóz donorként használt ribóz-1-foszfát nem stabil, és nem könnyen hozzáférhető, ezenkívül az eljáráshoz használt tisztított enzim előállítása sem egyszerű. Először azt találtuk, hogy a ribavirin mikroorganízmus-tenycszet, intakt mikroorganizmus-sejtek, vagy módosított mikroorganizmus-sejtek mint enzimforrás alkalmazásával, a mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között enzimatikus reakcióval állítható elő. A jelen találmány tárgya eljárás ribavirin előállítására oly módon, hogy l,2,4-triazol-3-karboxamidot vagy sóját, és ribóz donort az. alábbiakban megadott nemzetségek közül választott mikroorganizmusalapú enzirnforrás jelenlétében, amely enzimet tartalmaz, mely l,2,4-triazol-3-karboxamidból és ribóz donorból a ribavirin képződési reakcióját az adott mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között katalizálja, vizes közegben ériníkeztetjük, és a közegből à képződött ribavirint kinyerjük. Enzimforrásként alkalmazott mikroorganizmusok a következők; (1) a Brevibacterium, (2) a Corynebacterium, (3) az Arthrobacter, (4) a Micrococcus, (5) a Bacillus, (6) a Flavobacterium, (7) a Microbacterium vagy Bi ochothric, (8) a Xanthomonas, (9) a pseudomonas vagy Alteromonas, (10) az Achromobacter, (11) az Escherichia, (12) az Aerobacter, (13) a Sarcina, (14) a Staphylococcus, (15) a Bacterium, (16) a Serratia, (17) a Proteus, (18) a Cellulomonas, (19) az Enterobacter, (20) a Mycoplana, (21) a Vibro, (22) az Erwinia, (23) a Klebsiella, (24) az Acromonas, (25) a Mycotoruln és (26) a Candida ncmczelscgekhez tartozó mikroorganizmusok. A jelen találmányban a „mikroorganizmus alapú enzirnforrás” kifejezés alatt mikroorganizmus-tenyészetet, mikroorganizmus intakt sejtjeit vagy mikroor ganizmus módosított sejtjeit értjük. A jelen találmány és a régebb; fermentál v, valamint enzimatikus módszerek közötti legjellemzőbb különbség abban van, hogy a jelen találmányban a mikroorganizmus, tenyészetét, a mikroorganizmus intakt sejtjeit, vagy a mikroorganizmus módosított sejtjeit alkalmazzuk enzimkészítmenyként, és ezzel az 5 IC 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
