191263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hasnyálmirigy-eredetű, növekedési hormon kibocsátását elősegítő faktor előállítására
1 191 263 2 nálunk, és így mintegy 0,35 mmól Ala-t kötünk meg 1 g gyantán. Minden felhasznált oldószert gondosan gázmentesítünk valamely inert gáz, pl. hélium vagy nitrogén átbuborékoltatásával, az oxigén eltávolítása érdekében, amely a kén nem kívánatos oxidációját okozhatja a Met maradékon. A védőcsoport eltávolítása és semlegesítés után a peptid-láncot lépésről lépésre felépítjük a gyantán. A védőcsoportok eltávolítását, a semlegesítést és az egyes aminosavak beadagolását általában a Vale és munkatársai által részletesen leírt eljárással összhangban végezzük (4 292 313 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A védőcsoport eltávolítását előnyösen az „Á” táblázatban ismertetett eljárás szerint végezzük, amely a következő : A táblázat Lépés száma Reagensek , és műveletek Keverési idő (perc) 1. 60 % TFA/2 % etán-ditiol 10 2. 60 % TFA/2 % etán-ditiol 15 3. IPA/1 % etán-ditiol 0,5 4. Et3N(10 %) CH2Cl2-ben 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N(10 %) CH2Cl2-ben 0,5 7. . MeOH (kétszer) 0,5 8. CH2C12 (kétszer) 0,5 A kapcsolásokat előnyösen a „B” táblázatban ismertetett eljárás szerint hajtjuk végre, amely a következő: B táblázat Lépés száma Reagensek és műveletek Keverési idő (perc) 9. DCCI _ 10. BOC-aminosav 50-90 11. MeOH (kétszer) 0,5 12. CH2C12 (kétszer) 0,5 13. Ac2 (3 mólos) CH2Cl2-ben 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 16. CII2C12 (kétszer) 0,5 Röviden: I és 2 mmól közötti mennyiségű BOC- al védett és metilén-kloridban oldott aminosavat használunk egy gram gyantához, és 1 mól ekvivalenst DCCI-t 1,0 mólos metilén-kloridos oldat formájában. Amikor BOC-Arg (TOS)-t kapcsolunk, 50 % DM F és metilén-klorid elegyét használjuk. Bzl étert használunk, mint a Ser és Thr hidroxiloldalláncát védő csoportot. p-Nitro-fenil észtert (ONp) alkalmazunk az Asn vagy Gin karboxilvégének aktiválásához, és pl. BOC-Asn(ONf) kapcsolását egy éjszakán át végezzük, 1 mól ekvivalens HOBt-t használva DMF és metilénklorid 50 %-os elegyében; ebben az esetben DCCI-t nem adunk hozzá. Az Asn vagy Gin amino-csoportját Xan-nal védjük, amikor DCCI kötést használunk az aktiv észter módszer helyett. 2 Cl-Z-t alkalmazunk védőcsoportként a Lys oldalláncához. Tos-t alkalmazunk az Arg guanidino-csoportjának védőcsoportj.iként, a Glu vagy Asp karboxil-csoportját pedig OBzl-el védjük. A Tyr fenolos hidroxil-csoportját DCB-vel védjük. A szintézis végén a következő összetételt kapjuk: X1 - Tyr(X2) - Alá - Asp(X3) - Alá - Ile - Phe - Thr(X4) - Asn(X5) - Ser(X4) - Tyr(X2) - Arg(Xe) - Lys(X7) - Val - Leu - D - Alá - Gln(X5) - Leu - Ser(X4) - Alá - Arg(Xe) - Lys(X7)- Leu - Leu - Gln(X5) - Asp(X3) - Ile - Met - Ser(X4) - Arg(X6) - Gln(X5) - Gln(X5) - Gly - Glu(X3) - Ser(X5) - Asn(X5) - Gln(Xs) - Glu(X3) - Arg(X6) - Gly - Ala - Xs, ahol X1 jelentése BOC, X2 jelentése DCB, X3 jelentése benzil észter, X4 jelentése Bzl, X5 jelentése Xan, Xe jelentése Tos, X7 jelentése 2 Cl-Z és X8 jelentése -NH-gyanta. A Xan-t részlegesen vagy teljesen el lehet távolítva az a-amino-csoportot védő csoport eltávolítására használt TFA-kezelessel. Miután a befejező Tyr maradékot hozzákapcsoltuk a gyantához, a BOC csoportot eltávolítjuk 60 % TFA-val CH2CI2-ben. A védőcsoportok lehas'tása érdekében 1 g peptid-gyanta komplexumra számítva 1,5 mf anizolból, 0,5 ml metil-etil-szulfidból és 15 ml hidrogén fluoridból (HF) álló keveréket használunk, a kezelést —20 °C hőmérsékleten fel órán át, majd 0 °C hőmérsékleten fél órán át végezzük. A HF eltávolítása után nagy-vákuumban, a megmaradó gyanta-peptid komplexumot váltakozva mossuk száraz dietil-éterrel és kloroformmal, és azután a peptidet gázmentesített 2 n vszes ecetsavval locsoljuk, majd a gyantától szűréssel elkülönítjük. A lehasított és védőcsoportoktól megszabadított peptidet azután 0-5 %-os ecetsavban oldjuk és tisztítjuk, a tisztítás magában foglalhatja a Sephadex G-50 finom gélszűrést is. A peptideket ez után tovább tisztítjuk preparatív vagy félpreparatív HPLC-vel, amint ezt Rivier és munkatársai [Peptides: Structure and Biological Function (1979), 125— 128 oldal] és Marki és munkatársai [7. Am. Chem. Soc. 103, 3178 (1981)] leírtak. Röviden összefoglalva a Waters Associates prep LC- 500-hoz illő patronokat töltünk meg 15 — 20 C18 Silica-val (Vydac, 300A). CH3CN gradienst TEAP-ban alakítunk ki kis nyomású Eldex gradiens-készítőben, ahogyan ezt Rivier, J. leírta (J. Liq. Chromatography 1, 343-367 (1978)]. A kromatográfiás frakciókat gondosan követjük HPLC-vel, és csupán azokat a frakciókat gyűjtjük össze, amelyek jelentős tisztaságot mutatnak. A tisztított frakciók kisózásához, amelyeket egy-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
