191129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás riboflavin előállítására
1 191 129 2 A találmány tárgya eljárás riboflavin mikrobiológiai úton való előállítására. Ismert, hogy a riboflavint a gyógyszer- és élelmiszeriparban, valamint takarmányadalékként alkalmazzák. Ismert a riboflavin mikrobiológiai előállítására í olyan eljárás, amelynek során az Eremothecium ashbyii gomba tenyészetét hydrolt (a keményítő-előállítás mellékterméke, SO tömeg % glükózt tartalmaz) és kukoricaduzzasztólevet tartalmazó szója-fermentációs közegben alkalmazzák [389 132 számú szovjet szabadalmi leírás (1969)]. Ennek segítségével 96 órás fermentáció alatt a riboflavin koncentrációja 2000 - 2500 mg/liter-re dúsul. Ezt az eljárást jellemzi a tenyészet szaporodásának hosszadalmas időtartama és a tenyészetnek idegen mikroflórával való szennyeződéssel szemben mutatott, fokozott érzékenysége. Ismert továbbá a riboflavin előállítására egy olyan eljárás is, amelynek során a termelő törzs — a Bacillus subtilis törzshöz tartozó mikroorganizmusok — tenyésztését olyan tápközegen végzik, amely szénforrásként 8 % glukózt, továbbá ásványi sókat, valamint szaporodást serkentő anyagokként élesztőkivonatot, peptont, glutaminsavat, ribonukleinsav-készítményeket, purinokat és purin-analógokat tartalmaz (3 900 368 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1976). Ennek az eljárásnak a segítségével 44 órás fermentáció során 560 mg/liter koncentrációra dúsul a riboflavin. A riboflavin előállítására szolgáló előbbi eljárást jellemzi a baktériumok szaporodásának nagy sebessége, aminek következménye a fermentáció időtartamának csökkenése. Az eljárás hátránya azonban, hogy a Bacillus subtilis baktériumtenyészet elérhető aktivitása viszonylag csekély, másrészt bonyolult összetételű fermentációs és tenyésztő tápközegek alkalmazását igényli. A találmány alapját az a feladat képezi, hogy egy új, riboflavint termelő törzs alkalmazásával a végtermék hozama megnövekedjék, és az előállítás technológiai folyamata egyszerűsödjék. Ezt a feladatot úgy oldottuk meg, hogy a riboflavin süllyesztett kultúrával való elállításának eljárása során, amely a riboflavint termelő, Bacillus subtilis törzshöz tartozó mikroorganizmusnak egy olyan tápközegen való levegőztetésével történik, amely szénforrást, nitrogénforrást, ásványi sókat és szaporodást serkentő anyagokat tartalmaz, valamint a végtermék ezt követő elkülönítése során, a találmány szerint, riboflavint termelő mikroorganizmusként a Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45 törzset alkalmazzuk, amelyet génsebészeti módszerrel kaptunk, és az őssz-szövetségi Genetikai és Ipari Mikroorganizmusokat Szelektáló Tudományos-Kutató Intézet (a továbbiakban VNIIGenetika) Ipari Mikroorganizmusok Központi Gyűjteményében (a továbbiakban: TsMPM) TsMPM B- 2694 törzsszámmal letétbe helyeztünk. A riboflavin hozamának növelése céljából a szénforrást a tápközeghez kezdetben a közeg súlyára számítva 5-7 tömeg% mennyiségben, majd 12-18 órás tenyésztés után 3-5 tömeg % mennyiségben adagoljuk. A riboflavin hozamának növelése céljából célszerű a tenyésztést 39-41 *C hőmérsékleten végezni. A találmány szerinti eljárással lehetővé válik, hogy a riboflavin hozamát az ismert előállítási módszerrel összehasonlítva az igen aktív termelő törzs alkalmazásával 4—8-szorosára növeljük. Az eljárás ezen kívül azt is lehetővé teszi, hogy egyszerű, könnyen hozzáférhető tápközegeket alkalmazzunk. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott, új, riboflavint termelő Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45 törzset génsebészeti módszerrel hoztuk létre. A VNIIGenetika 304/pMX45 létrehozása a követikezd lépésekből áll: 1. Génsebészeti módszerrel képezzük a Bacillus subtilis (a továbbiakban: B. subtilis) riboflavinoperont hordozó hibrid-plazmidot. 2. Az így kapott plazmidot bevezetjük a befogadó (recipiens) törzsbe. 3. Biztosítjuk a riboflavin-operon érvényesülését (kifejeződését) a gazdasejt plazmidjának állományában. A pMX33 vektorhoz - amely a baktériumok eritromicinnel szemben való ellehállását meghatározza, és molekulasúlya 12 Mdalton - a dezoxiribonukleinsavnak azt a szakaszát kapcsoltuk, amely a Bacillus subtilis riboflavin-operonjának génjét tartalmazza. Ennek eredményeként olyan hibrid-plazmidot kaptunk, amely a 20 pg/ml mennyiségű eritromicinnel szemben való ellenállást biztosítja, s ezt pMX45-nek jelöltük (molekulasúlya 18 Mdalton). Befogadó (recipiens) törzsként — amelybe a pMX45 plazmidot bevezettük - a B. subtilis VNIIGenetika 304 törzset alkalmaztuk, amelyet a VNIIGenetika TsMPM gyűjteményében TsMPM B- 2117 törzsszámmal letétbe helyeztünk. Ezt a recipiens törzset genetikai módszerekkel olyan, függetlenül kapott mutációkból hoztuk létre, amelyek mindegyike vitamin-hiperszintézisre képes. Ezek jellemző jelölése: rosr — ribe - AGR(„rosr” jelenti az ellenállást roseoflavinnal szemben ; „ribe” jelenti a mutációt a szabályzó génben; „AGR” jelenti az ellenállást a 8-azaguaninnal szemben). Ezt követően végeztük a mutagén megmunkálást nitrozo-guanidinnel, nitrozometil-karbamiddal, ibolyántúli besugárzással, majd az aktív variánsoknak fermentációs táptalajon való szelektálása útján. A pMX45 plazmidot a befogadó törzsbe a genetikai transzformáció módszerével vezettük be. A transzformánsokat a 20 pg/ml koncentrációjú eritromicinnel szembeni ellenállás és a riboflavin-bioszintézis fokozódásának alapján választottuk ki. Azokban a transzformánsokban, amelyek egyidejűleg hordozták a hibrid-plazirtidot és a kromoszómában azokat a géneket, amelyek a riboflavin konstituciós szintézisét biztosítják, a hibrid-plazmid állományában a riboflavin-operon hatékony érvényesülését állapítottuk meg. A Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45 törzs 4500 mg/literig terjedő mennyiségű riboflavin (B2 vitamin) szintézisére képes. A Bacillus subtilis VNIIGenetika 304/pMX45 törzs morfológiai és tenyészeti (kultúra-) jellemzői a B. subtilis VNIIGenetika 304 befogadó törzs jellemzőihez hasonlók. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
