190949. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonadotropin hormont felszabadító hormon antagonista peptidek előállítására
1 190 949 2 azol csoportjának vagy amino-csoportjának védelmére szolgáló csoport, pl. nitro-, Tos, tritil-, benziloxi-karbonil-, adamantil-oxi-karbonil-, Z és Boc; vagy a Trp-hez szükséges védőcsoport, amelyet már az X2-nél tárgyaltuk; vagy X5 lehet hidrogénatom, ami azt jelenti, hogy nincs védelem az oldalláncok csoportjain. A Tos általában előnyös csoport. Amikor X jelentése acetil-csoport a végső képletben, ezt lehet használni X1 védő-csoportként is a D-NAL a-amino-csoportjához vagy bármilyen aminosavhoz, amelyet az 1. helyzetben alkalmazunk, olyan módon, hogy ezt az utolsó aminosavnak a peptid-lánchoz történő kapcsolása előtt adagoljuk. A reakciót azonban előnyösen a gyantán rögzített pepiiddel hajtjuk végre (az a-aminosav csoport felszabadítása után, miközben az oldallánc csoportok védve maradnak), pl. diciklohexil-karbodiimid (DCC) jelenlétében ecetsavval vagy előnyösen esetsav-anhidriddel reagáltatva vagy más megfelelő reakciót alkalmazva, amint ezek a szakterületen ismertek. A teljes mértékben védett pepiidet a klór-metilezett gyantáról ammonolízissel hasíthatjuk le, amely művelet a szakterületen jól ismert, igy teljesen védett amid köztes terméket nyerünk. A peptid védőcsoportjainak eltávolítása, valamint a peptid lehasítása a benzhidril-amin gyantáról 0 °C hőmérsékleten fluor-hidrogénnel (HF) hajtható végre. Előnyösen anizolt is adunk a peptidhez a hidrogénfluoridos kezelés előtt. A hidrogén-fluorid eltávolítása után vákuumban, a lehasított, védőcsoportjait elvesztett pepiidet éterrel kezeljük, dekantáljuk, híg ecetsavban felvesszük és liofilezzük. A találmány tárgya tehát eljárás (I) általános képletű peptidek előállítására: X-R,-R2-IVR4-R5-R«-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (I) A képletben X jelentése ß-D-2NAL vagy dehidro-Pro, R2 jelentése 4-halogén-D-Phe, R3 jelentése D-Trp vagy ß-D-2NAL, R4 jelentése Ser vagy Om, R5 jelentése Tyr, 2-F-Phe, 3-F-Phe, 2-Cl-Phe, 3-C1- Phe, 2-CH3-Phe, 3-CH3-Phe vagy 3-I-Tyr, R* jelentése D-Trp, D-Arg, D-His, 4-gua-D-Phe, ß-D- 2NAL, azzal a feltétellel, hogy R3 jelentése csak akkor ß-D-2NAL és R4 jelentése csak akkor Om, ha ezek együtt fordulnak elő, és ha Rs jelentése Tyr és Rg jelentése ß-D-2NAL. A találmány értelmében az (I) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy I. a peptidkémiában ismert módszerekkel, alkalmas oldószerben, előnyösen metilén-kloridban vagy dimetil-formamidban vagy ezek elegyében 1 g hordozógyantán 2-2 mmól mennyiségű kívánt esetben védett aminosavak kondenzálásával (II) általános képletű vegyületet állítunk elő : X-R1-4-halogén-D-Phe-R3(X2)-R4(X3)-RJ(X4)■R6(X5)-Leu-Arg(X5)-Pro-Gly-NH-(hordozógyanta) (II) A képletben Rt, R3, R4, Rs, R^ és X jelentése megegyezik az (I) általános képletnél megadottakkal, X2 jelentése hidrogénatom vagy az indol nitrogénjét védő csoport, X3 jelentése hidrogénatom vagy a Ser alkoholos hidroxilcsoportját vagy oldalláncbeli aminocsoportot védő csoport, X4 jelentése hidrogénatom vagy a Tyr fenolos hidroxilcsoportját védő csoport, Xs jelentése hidrogénatom vagy az Arg vagy His oldalláncát védő csoport, 2. a védőcsoportokat lehasítjuk és a terméket a hordozógyantáról előnyösen hidrogén-fluorid segítségével egy tisztítóanyag, előnyösen anizol jelenlétében, 0 és - 20 'C közötti hőmérsékleten lehasítjuk, majd kívánt esetben alkalmas oldószerben, előnyösen ecetsavban oldjuk, és ismert módon tisztítjuk. A peptid tisztítását ioncserélő kromatográfiával hajtjuk végre CMC oszlopon, ezt követi vagy a megoszlásos kromatográfia a következő eluáló rendszert használva: n-butanol-0,1 n ecetsav (1:1 térfogat-arányban) egy Sephadex G-25-tel töltött oszlopon, vagy HPLC (nagy nyomású folyadékkromatográfia), amint ez a szakterületen ismert. A találmány szerinti peptidek kevesebb, mint 100 mikrogramm/testsúly kg szinten hatásosak a nőstény patkányok ovulációjának megakadályozására, ha a prooestrus napján kb. délben beadjuk. Az ovuláció hosszan tartó visszaszorítására kb. 0,1-2,5 mg/testsúly kg értékek közti dózis-szintet kell alkalmazni. Ezek az antagonisták hatásosak a sperma-képződés megakadályozására is, amikor hím emlősöknek adjuk be szokásos módon és igy fogamzásgátlóként itt is használható. Mivel ezek a vegyületek csökkentik a tesztoszteron-szintet (amely nem kívánatos következmény egy normális, szexuálisan aktív hímnél), ésszerű beadni pótló tesztoszteron-adagokat a GnRH antagonistákkal együtt. Ezeket az antagonistákat lehet alkalmazni a gonadotropinok és szexuál-szteroidok szabályozásához egyéb célokból is, amint ezt már korábban jeleztük. PÉLDA Az I. táblázatban található peptidek a következő képlettel rendelkeznek : Ac-R,-R2-R3-R4-R5-R6-Leu-Arg-Pro-R10, és ezeket a fentebb megnevezett szilárd fázisú eljárással állítjuk elő. Abból a célból, hogy bemutassuk az eljárást, az 1. sz. peptid szilárd fázisú szintézisére adunk példát, amelyet [Ac-ß-D-2NAL1,4-F-D-Phe2, D-Trp3, 2-CH3-Phe5, D-Arg^-GnRH-nak nevezünk. Ennek a pepiidnek a teljes képlete a következő: Ac-ß-D-2NAL-4-F-D-Phe-D-Trp-Ser-2-CH3-Phe-DArg-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
