190814. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új poliéter típusú antibiotikumok előállítására
1 2 .190 814 12 515 fagyasztott törzstenyészetével beoltunk és 32 °C hőmérsékleten rotációs rázógépen rázatva 2 napig inkubáljuk. A két lombik tartalmát egyesítjük és 20 literes palackban lévő 121 friss, steril A táptalajt oltunk 5 be vele. A 20 literes palackban lévő tenyészetet ezután 28 °C hőmérsékleten levegőztetve 2 napon át inkubáljuk. A palack tartalmát ezután 300 literes, 2881 steril A táptalajt tartalmazó anyakultúra tartályba visz- 10 szűk, 32 'C hőmérsékleten 25 órán át levegőztetjük és keverjük. A 25 órás inkubálás elteltével a 3001 anyakultúrát 1500 literes, 12001 steril C táptalajt tartalmazó fermen torba visszük. Ezt a tenyészetet 28 °C hő- 15 mérsékleten 115 órán át levegőztetve és keverve inkubáljuk. A fermentlé antibiotikus aktivitását vékonyrétegkromatográfiás eljárással vizsgáljuk, szilikagéllemezen etil-acetát, kloroform 70 : 30 térfogat ará- 20 nyű elegyét használva futtatóként. Alternatív megoldásként a megfuttatott lapok közül néhánynak Bacillus szubtilisra kifejtett biológiai hatását is megvizsgáltuk, a vizsgálat antibiotikus aktivitás jelenlétét mutatta. 25 6. Példa értékre állítjuk, majd a táptalajt sterilezzük. 300 literes fermentorban lévő 2501 fenti táptalajt az 1. példában megadott eljárással készült inokulum 30 literével oltunk be. A tenyészetbe steril levegőt vezetünk és 220 fordulat/perc fordulatszámú keverővei keveijük. A fermentációt 32 °C hőmérsékleten 97 órán át folytatjuk, majd a sejttömeget összegyűjtjük. 8. Példa Az alábbi összetevőkből fermentációs táptalajt készítünk : Dextróz 3,0% Szójaliszt 1,5% Kalcium-karbonát 0,1 % Nátrium-klorid 0,3 % Víz kiegészítésül 100%-ra A táptalaj pH-ját 6n nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre állítjuk, majd a táptalajt sterilezzük. 30001 így készült táptalajt fermentorban 300 1, az 1. példában leírt eljárással készült inokulummal oltunk be. A tenyészetet steril levegővel levegőztetjük és 100 fordulat/perc fordulatszámú keverövel keverjük. A fermentációt 32 °C hőmérsékleten 115 órán át folytatjuk, majd a sejttömeget összegyűjtjük. A primer inokulum tenyésztésére szolgáló jellegzetes táptalajt a következő összetevőkből készítünk: Marhahús kivonat 0,3% Bacto® - tryptone 0,5% Glükóz 1,0% Élesztőkivonat 0,5% Bacto® agar 0,15% Víz kiegészítésül 100%-ra 500ml-es lombikban lévő, fenti összetevőkből álló steril táptalajt Actinomadura yumaense NRRL 12 515 ferdeagar tenyészetről lemosott vagy lekapart spórával és miléciummal oltunk be, majd a lombikot rotációs rázógépbe helyezve 32 °C hőmérsékleten 48 órán át erőteljesen rázatjuk. A kapott 100 ml inokulummal 2 literes palackban lévő 1 1 azonos összetételű táptalajt oltunk be. Ezt az inokulumot steril levegővel levegőztetve 28 °C hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk. A kapott 1 1 tenyészettel 30 literes fermentorban lévő azonos steril táptalajt oltunk be és steril levegővel levegőztetve 28 °C hőmérsékleten 42 órán át inkubáljuk a tenyészetet. 7. példa Az alábbi összetevőkből fermentációs táptalajt készítünk : Dextróz 1,5% Glicerin 1,5% Szójaliszt 1,5% Kalcium-karbonát 0,1% Nátrium-klorid 0,3% Víz kiegészítésül 100%-ra A táptalaj pH-ját 6 n nátrium-hidroxiddal 7,0 9. Példa 1. A fermentléből kinyert 1001 sejttömeg pH-ját 6 n hidrogén-kloriddal pH 4,0 értékre állítjuk. Ezután a savas sejttömeget azonos térfogatú metilénkloriddal 1-2 órán át keverjük. A sejttömeg-metilén-klorid elegyet szűrő segédanyagként kovaföldet használva leszűrjük. A metilén-kloridos extraktumot elválasztjuk és vákuumban bepároljuk, így körülbelül 21 részlegesen tisztitott antibiotikumot nyerünk. 2. A részlegesen tisztított antibiotikum kromatografálása szilikagélen. 7 cm átmérőjű üvegoszlopot 91 cm magasságig megtöltünk Woelm szilikagél TSC-vel. Az e példa 1. részében leírt eljárással nyert körülbelül 2 1 térfogatú nyers koncentrátumot az oszlopra öntve hagyjuk abba beszívódni. Ezt követően az oszlopot először 3 1 metilén-kloriddal majd annyi 1 : 1 térfogat arányú metilén-klorid, etil-acetát eleggyel eluáljuk, hogy 126, egyenként 80-80 ml térfogatú frakciót gyűjthessünk. Ezután 7 : 3 térfogatarányú etilacetát-etil-alkohol eluens elegyet használva még 87 frakciót szedünk. Az LL-C23 024a-ban gazdag 58-87. frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, 90,4 g maradékot kapunk. Ezt a maradékot 600 ml dietil-éter és 600 ml hexán elegyében feloldjuk. A kapott szuszpenziót tisztára szűrjük. A tiszta szűrletet vákuumban a kristályosodás megindulásáig pároljuk be, majd egy éjszakán át állni hagyjuk. A kapott kristályos LL-C23 024a jelzésű anyagot tölcséren gyűjtjük, hideg éterrel mossuk, levegőn szárítjuk; így 33,1 g kristályos anyagot kapunk. További 12,4 g LL-C23 024a jelzésű anyagot kapunk az elegyített mosófolyadék és szűrlet további bepárlásával. 15
