190803. lajstromszámú szabadalom • Ráksejt elleni limfociták, valamint rákellenes hatóanyagok előállítására, amelyek az említett limfociátkat tartalmazzák
1 190 803 2 centrációjú (fehérjetartalom) GRA-M-5-tel, RPMI-1640 tápközegen, amely 15% FCS-t tartalmaz. Az érzékenyítést 5 napig végezzük, így killer sejteket nyerünk. A normál lépből nyert killer sejteket az alábbiakban GRA-M-5-K-T-l-nek az immunis egér lépéből származókat pedig GRA-M-5-K-T-2-nek nevezzük. 6. példa Humán perifériás vérből származó limfocitákat (5x10®) 50 ng/ml koncentrációjú (fehérjetartalom) GRA-l-et tartalmazó RPMI-1640 tápközegen inkubálunk 37 °C-on két napig. A harmadik napon a limfocitákat átvisszük olyan RPMI-1640 tápközegbe, amely 10%, a limfocita donortól származó szérumot, valamint 0-100 ng/ml (proteintartalom) GRA-l-t tartalmaz. Az inkubálást további 5 napig folytatjuk, hogy killer sejteket nyerjünk. A készítményeket a 4. táblázat mutatja be. 4. táblázat GRA koncentráció (ng/ml) Kezdőnap 3. nap Killer sejt 50 0 GRA-l-K-T-1 50 1,6 GRA-l-K-T-2 50 3,2 GRA-l-K-T-3 50 6 GRA-l-K-T-4 50 12,5 GRA-l-K-T-5 50 25 GRA-l-K-T-6 50 50 GRA-l-K-T-7 50 100 GRA-l-K-T-8 7. példa (a) Már megműtött, különféle rákos megbetegedésben szenvedő betegek perifériás véréből nyert limfocitákat GRA-3-mal érzékenyítjük, hogy killer sejtkészítményeket nyerjünk. A betegekből származó PBL-t (perifériás vérből vett limfocita) (5 x 10®) 50 ng/ml (proteintartalom) GRA-3-at tartalmazó RPMI-1640 tápközegben inkubálunk két napon át, majd 20% TCGF-et és 15% FCS-t tartalmazó RPMI-1640 közegben további öt napon át inkubáljuk, hogy killer sejteket nyerjünk, ahogy azt az 5. táblázat mutatja. 5. táblázat Rák P-GRA D-GRA A műtét utáni napok Killer sejt Gyomorrák + + 14 GRA-3-K-T-1 Gyomorrák + + 35 GRA-3-K-T-2 Emlőrák +-21 GRA-3-K-T-3 Emlőrák +-7 GRA-3-K-T-4 Emlőrák +-35 GRA-3-K-T-5 Gyomorrák + 21 GRA-3-K-T-6 A fenti táblázatban a P-GRA és a D-GRA jelzi a GRA elhelyezkedését a műtéti úton eltávolított daganatszövetben, az 1. és 2. (b) tájékoztató példákban ismertetett eljárás szerint meghatározva. A tumorszövet olyan betegektől származik, akiktől előzőleg a PBL-t gyűjtöttük. A P-GRA és a D-GRA eredményeit a FITC-PNA illetve a FITC-DBA alkalmazásával nyerjük. A műtét utáni napok azt az időt jelzik, amikor a PBL-t a műtét után gyűjtjük. (b) A PBL-t (5x 10®) emlőrákos betegektől a műtét utáni 21. napon gyűjtjük és RPMI-1640 közegben inkubáljuk, amely 50 ng/ml (proteintartalom) GRA-3-at és a 7. naptól a betegből származó 10%-os szérumot tartalmaz, ily módon érzékenyítjük a PBL-t és killer sejt készítményeket kapunk. A továbbiakban ezt a GRA-3-K-T-7-nek nevezzük. 8. példa (i) A (2) tájékoztató példa (2)-b pontja szerinti eljárással nyert GRA-M-l-et fiziológiás sóoldattal hígítjuk, úgy hogy a cukor és a fehérje mennyisége 1,0 pg/ml illetve 1,6 pg/ml legyen, hogy előállítsuk az 1. számú rákellenes készítményt. (ii) Spontán keletkezett emlőrákból származó C3H/He rákos daganatot csíramentesen 5 mm-es kockaalakú darabokra vágjuk és átültetjük azokat 10 db C3H/He azonos törzsű egerek hátsó bőre alá (7 hetes hím egerek). Az átültetés után 7 nappal bizonyítható a rák rögzülése és terjedése. A fenti 10 egérből 5 darabot az (i) pont szerinti 1. számú rákellenes készítmény szubkután adagolt 300 ni/ napos adagjaival 2 napos időközönként kezeljük. A másik 5 egér a kezeletlen ellenőrző csoportot képezi. Tíz nappal az első kezelés után a rákot műtéti úton kimetsszük és átlagsúlyát lemérjük. Ugyanabban az időben szövettani vizsgálatot is végzünk. Tumor térfogat: Kezelt csoport 22,3 mm3 (14. ábra) Kezeletlen csoport 162,6 mm3 (15. ábra) E szerint a tumor 86,3%-os csökkenése tapasztalható. Szövettani vizsgálat: Az összehasonlító csoportban (15. ábra) fészkes szerkezetű tumor keletkezett, a szövet típusa velős szerkezetű rákhoz hasonló, és a tumorsejtek szaporodása az egész szövetre kiterjedt. Másfelől, a hatóanyaggal kezelt csoportban (16. ábra) a rákos sejtek elfolyósodtak, elhaltak, elmeszesedtek, valamint elrostosodtak. Nagyon kis mennyiségű rákos sejt maradt életben. így tehát megfigyelhető a találmány szerinti rákellenes készítmény daganatgátló hatása. /. Teszt példa Az 1. példa szerinti eljárással előállított GRA-l-K-T 1 pl-ét tárgylemezre helyezzük (a Falcon Corp. terméke) és szobahőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk. Ekkor 4 pl FCS-et (a Falcon Corp. terméke) adunk hozzá és az elegyet 30 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 1 x 10® ml neuraminidázzal kezelt birka vörösvérsejteket (SRBCN) adagolunk, és 5 pl 0,01 mól foszfátpuífert 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
