190751. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mixotfóf szövettenyészetek és herbicidrezisztens növények előállítására
12 190751 13 pH 5.6. A kapóit azuszpenziót újra centrifugáltuk (50 g, 2 perc). A centrifugaceó aljában összegyűlt proloplasztokat 0,4 M glükózt tartalmazó K3 tápoldatban tenyésztettük (1 x x 105 proloplaszt/ml) 100 lx megvilágítás mellett, 25 °C-on. A tenyészeteket 7-10 naponként csökkenő glükóz-koncentrációjú v(0,4; 0. 3; 0,2; 0,1 M) K3 tápoldattal hígítottuk 30-40-szeres végső hígítás eléréséig. A tenyésztés megindítása után kb. 6 héttel a sejtkolóniákat 0,3% szacharózt és 0,4 M terbutrint tartalmazó, egyébként az 1. példában megadott összetételű, táptalajba szélesztettük (10-szeres hígítás, ami végül kb. 1000 kóló-, nia/10 cm átmérőjű Petri-csésze kolóniasűrű-1 séget jelentett). A kolóniákat 1500 lx megvilágítás mellett, 28 °C-on tenyésztettük. 1-2 hónap múlva a zöldülésre képes kolóniákat izoláltuk, majd ugyanazon a táptalajon kalluszmérelűvé növesztettük. Ezekből növényeket regeneráltattunk, 2% szacharóz-koncentrációjú terbutrint nem tartalmazó, egyébként a szelekcióhoz használttal azonos összetételű táptalajon. Egy hónapos növesztés után hajtások jelentek meg, amelyeket olyan táptalajon gyökereztettünk és tartottunk fenn, mint az 1. példában leírt. A növesztést körülbelül 10 cm-es méret eléréséig folytattuk. A 10 cm-es növények leveleiből vágott darabkákat 0,3% szacharózt és 0,4 M terbutrint tartalmazó, egyebekben az 1. példában megadott összetételű táptalajra helyeztünk, majd a tenyésztést az 1. példában ismertetett eljárással folytattuk. Négy hét elteltével vizuális kiértékeléssel ellenőriztük a regenerált növények rezisztenciáját. A rezisztencia kifejlődése esetén mind a kallusz, mind a tenyésztéshez felhasznált levéldarabka zöld, míg nem rezisztens növények esetén a kallusz fehér, éB a levéldarabka íb kifehéredik. A rezisztens sejtvonalak megjelenési gyakorisága kb. l/10s kolónia volt. A kísérletet terbutrin helyett metobromuron herbicidet használva megismételtük. Rezisztens sejtvonalakat ebben az esetben is izoláltunk éB a rezisztencia kifejeződött a regenerált növényekben is. A rezisztens sejtvonalak megjelenési gyakorisága kb. 1/ / 10s kolónia volt. Ugyancsak analóg eredményeket kaptunk, ha a kísérleteket Solanum tuberoeummal végeztük. 6. példa Herbicidrezisztencia dohányfajok közötti átvitele protoplasztfúzióva! A kísérlet célja atrazin-rezisztons kloroplnsztiszok átvitele volt egy mutáns gyom- 5 növényből (Solanum nigrum) dohányba (Nicotians plumbaginifolia), illetve burgonyába. Az átvitelt a protoplasztok tenyésztésére az 5. példában ismertetett eljárással, protoplnszfúzión alapuló kloroplasztátviteli módszerrel 10 végeztük ÍMenczel és misai: Genetics 100, 487-95 (1982); Medgyesy éa mtsai: Molec. Gen. Genet. 179, 693-698 (1980), melynek során felhasználtuk azt, hogy alacsony cukorkoncenlráción ki tudjuk szelektálni a rezisztens 15 kloroplasztiszokat tartalmazó sejtvonalakat. A rezisztencia átvitelét, azaz a rezisztencia megjelenését a vizsgált kultúrnövényben az 5. példában ismertetett módszerre) ellenőriztük. 20 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás mixotróf szövettenyészetek 25 előállítására magból, bármely növényi részből, protoplasztból vagy egyedi sejtből előállított fotoszintézisre képes vagy fotoszintézisre képes részeket tartalmazó szövetlenyészetben, cukrot tartalmazó ismert táptalajon, 30 megvilágítás mellett végzett tenyésztéssel, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 1%-nál kevesebb cukrot tartalmazó táptalajon végezzük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 35 jellemezve, hogy a tenyésztést 0,2-0,8% cukrot tartalmazó táptalajon végezzük. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 0,2- -0,5% cukrot tartalmazó táptalajon végezzük. 40 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 0,2-0,3% cukrot tartalmazó táptalajon végezzük. 5. Eljárás fotoszinlézisgátló herbicidekre 45 rezisztens növények előállítására, szövettenyészetben végzett szelekcióval, azzal jellemezve, hogy egy az 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított mixotróf szövettenyészetet fotoszinlézisgátló herbiciddel keze-50 lünk, a tenyészet zöldülésre képes részeit izoláljuk, majd ezekből ismert módon növényeket regeneráltatunk. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljáráBt sejtgenetikai 55 módszerekkel módosított kiindulási anyagból előállított mixotróf szövettenyészelen hajtjuk végre. 60 Rajz nélkül A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 8 88.348.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
