190747. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás reagenskészlet progeszteron kimutatására és meghatározására biológiai folyadékokból
2 1 190 747 őrzésére, valamint a meddőség egyes eseteinek felismerésére. c) A progeszteron elleni (első) antitestet olyan új immunizálási séma alapján állítjuk elő, amelynek eredményeképpen EIA módszerünk érzékenysége 0,01 pmol alatt van. d) Az eljárás nem igényel nagy tisztaságú peroxidáz enzimet. e) Elválasztási módszerünk módosított második antitest eljárás, mellyel kiküszöbölhetők mind a szilárd fázisú módszerek hátrányai, mind az eredeti kettős antitest módszer időigényessége. f) Az enzimreakció kényelmes kivitelezésére kimért mennyiségű, stabilizáló töltőanyaggal kapszulázott kromogént (ortofenilén-diamin, OPD) és tablettázott karbamid peroxid szubsztrátot használunk. g) Az előbb leírt módosításokkal eljárásunk lehetővé teszi az extrakció nélküli, ún. direkt progeszteron meghatározást biológiai folyadékokból. A találmány szerinti eljárás kivitelezésére olyan reagens készletet állítottunk elő, amely minden, a meghatározáshoz szükséges vegyszert tartalmaz az alábbiak szerint: a) progeszteron és peroxidáz kovalens kapcsolásával készült folyékony konjugátumot b) liofiiizált anti-progeszteron szérumot c) liofiiizált anti-nyúl IgG birkaszérumot d) szilárd alakú polietilénglikolt e) liofiiizált normál nyúlsavót f) a pufferek tízszeres töménységű törzsoldatát g) a stabilizálószerrel kevert és kapszulázott kromogént h) a tablettázott szubsztrátot (karbamid peroxid) i) az enzimreakciót leállító kénsavoldatot valamint j) liofiiizált, progeszteron tartalmú standard sorozatot, továbbá adott esetben k) kis és nagy progeszteron koncentrációjú mintákat l) a mérési sorozat grafikus értékeléséhez skálabeosztással ellátott diagram papin m) a méréshez szükséges edényzetet. A találmányt az alábbi példák szemléltetik: 1. példa Progeszteron meghatározása emberi vérszérumból vagy vérplazmából a) progeszteron llo-hidroxi-hemiszukcinát-BSA immunogén előállítása 0,12 mmol progeszteron—11 cehidroxi-hemiszukcinátot (P-HS)-t és 0,12 mmol vízmentes tributilamint (TBA) oldunk 4 ml vízmentes tetrahidrofuránban (THE), 0 °C-ra hűtjük, majd 0,12 mmol izobutíl-kloroformátot (IBCF) mérünk hozzá. Az oldatot 0 °C-on 20 percig inkubáljuk, majd 100 mg zsírsavmentes BSA 1:1 térfogatarányú dioxán-víz keverékkel készült oldatához adjuk. 4 °C-on folytonos keverés közben 4 órán keresztül inkubáljuk, közben a pH-t folyamatosan 8,5—9 közé állítjuk NaOH- dal. Az anyagot 24 órán keresztül csapvízzel szemben dializáljuk. A térfogatot desztillált vízzel 50 ml-re egészítjük ki, 20 ml acetont adunk hozzá és ecetsavval pH-t 4,5-re állítjuk be. 3 órás 4 °C-os állás után a csapadékot lecentrifugáljuk és 50 ml vízben oldjuk néhány csepp 1 n NaHC03 segítségével. Az adszorbeált, nem kötött haptén eltávolítása érdekében a precipitációs eljárást kétszer megismételjük. Az utoljára nyert csapadékot 1—2 ml vízben oldjuk, pH-ját 7,5-re állítjuk (NaOH) és gyors fagyasztás után liofilezzük. A haptén: carrier arányt adott paraméterek mellett a haptén-IBCF-TBA mennyiségének párhuzamos változtatásával érjük el. Adott anyagok mennyiségét 0,005 és 0,25 mmol között változtatva a carrier: haptén arányt közel li- 5 neárísan 1:1—45 között állítjuk be. A haptén: carrier arányt differenciál-fotospektrum (P-HS esetén 248 vs. 278 run), valamint izotóp beépülés mérés segítségével ellenőrizzük. b) Anti-progeszteron szérum előállítása y g Az immunogént (lásd a) pont) fiziológiás konyhasó oldatban feloldjuk és Freund adjuvánssal homogenizáljuk, majd 5 hetenként több helyre elosztva nyúl bőre alá oltjuk. A kiindulási oltáshoz 1000 /tg antigént használunk. Nyolc emlékeztető oltás során az antigén mennyiségét fo- 15 kozatosan 100 /tg-ra csökkentjük, az alábbiak szerint: 600, 300, 250, 250, 200, 200, 100, 100 /tg. Az állatot a 7. oltás után kezdjük véreztetni, oltás után 10 nappal. Ez úgy történik, hogy az állat fülét — az alvadás késleltetése érdekében — beszilikonozzuk, majd a marginális vénájá- 20 bői 20—40 ml vért veszünk. Az ellenanyagot tartalmazó szérumot elválasztjuk, gyorsfagyasztjuk, liofilizáljuk és hűtve tároljuk. Az így előállított ántiprogeszteron antiszérum minőségi jellemzői a következők: 25 Kötési kapacitás 1,10 /ig/ml Asszociációs konstans Keresztreakciók 4,83 x 10’° 1/mol progeszteron 100% koleszterin <10'6% 30 pregnenelon 0,008 % dezoxikortikoszteron 0,92 % kortikoszteron 0,16 % tesztoszteron 0,022 % kortizol 0,0024% 35 androszténdion 0,04 % 20-a-dihidroprogeszteron 0,14 % 17- x a-OH-progeszteron 0,92 % c) Jelzett progeszteron (progeszteron-HRP konjugátum) előállítása 40 7,4 mg progeszteron-lla-hidroxi-hemiszukcinátot 150 /d dimetilformamidban (DMF) feloldunk és 1,8 /d N-metil-morfolint adunk hozzá, majd szárazjég-alkohol keverékkel az oldatot —15 °C-ra hűtjük, utána 1,14 /ti izobutii-kloroformátot adunk hozzá, és 3 percig kevertet- 45 jük. Közben 2,7 mg tormaperoxidáz enzimet (HRP, RZ = 1,5, Reanal) 150 /ti desztillált víz és 100 /d DMF keverékében feloldunk és —15 °C-ra hűtjük. A vegyes arthidridet tartalmazó oldatot az így elkészített enzim oldathoz csepegtetjük, majd a reakcióelegyet először —15 °C-on 1 50 órát, majd 4 °C-on két órát kevertetjük. Ezt követően 3 mg NaHCOj-ot adunk a keverékhez, és egy éjszakán át csapvízzel szemben dializáljuk. A dialízis után Sephadex G—25 kromatográfiával a szabad progeszteront és a keletkezett progeszteron HRP konjugátumot szétvá- 55 lasztjuk. Az így nyert konjugátum immunreaktivitása 50—80%. A konjugátumot hígító pufferrel (lásd i) pont) előhígított formában 4 °C-on tároljuk. d) Anti-nyúl IgG birkaszérum 60 A második antitestként használt antiszérum a kereskedelmi forgalomban beszerezhető minőségű, pl. a HUMAN Oltóanyagtermelő és Kutató Intézet 3C-ShARb-IgG kódjelű terméke. e) Normál nyúlszérum 65 3
