190680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6"-O-karbamoil-tobramicin előállítására mikrobiológiai úton
8 190680 9 2. táblázat Fermentációs Nebramicin-komponens idő (óra) {/ug/ml) 2 4 5’ 24 0 0 50 48 0 0 400 72 0 5 1200 96 0 30 1740 120 0 40 2320 144 -0 60 2650 c.) A nebramicin-5' dekarbamoilezése és á tobramicin izolálása 3,0 liter 2600 /ug/ml nebramicin-5’-t és 90 /ug/ml nebramicin-4-et tartalmazó ferment- 20 léhez 22 g nátrium-hidroxidot adunk. A fermentlevet ezután keverés közben 90-100 °C hőmérsékletre melegítjük, és 25 percen ét ezen a hőmérsékleten tartjuk. A reakcióidő letelte után szobahőmérsékletre hűtjük, majd pH-ját 50%-os vizes kénsav oldattal 2,0-re állítjuk be. Az így kapott savanyú fermentléhez állandó keverés közben 6 g oxálsavat adunk, majd pH-jét tömény ammónium-hidroxiddal 7,0-re állítjuk be és 30 percen át 30 keverjük. Ezután szűrjük, majd a micéliumot 2x600 ml vízzel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük. Az így előállított kalciumion-mentes oldatot 200 ml Amberlite CG-50 (NH«*-ciklusban) gyantából (Rohm and 35 Haas Co., Philadelphia, USA) készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 400 ml ionmentes vízzel mossuk, majd 1000 ml 0,05N, 2000 ml 0,1N és végül 3000 ml 0,15N ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk. Az eluáláskor 40 250 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A tobramicint tartalmazó 13-18. frakciókat egyesítjük, az oldat pH-ját 50%-os kénsav oldattal 7,0-re állítjuk be és 120 ml Amberlite 5 CG-50 (NHN-ciklusban) gyantán kromatografáljuk. 200 ml ionmentes vízzel mossuk a gyantaágyat, majd az antibiotikumot 1000 ml 0,05N, 2000 ml 0,1N, 2000 ml 0,15N és végül 2000 ml 0,2N ammónium-hidroxid oldattal elu- 10 áljuk. 60 ml térfogatú frakciókat szedünk. A 45-56. frakciókat egyesitjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékot foszfor-pentoxid felett szárítjuk. így 0,7 g 70% kanamicin B-t. 12% N-13 kompo- 15 nenst (6’-N-karbamoil-tobramicin). 10% ismeretlen komponenst és 8% tobramicint tartalmazó terméket kapunk. Az 57-58. frakciókat desztillálva 0,2 g, 60% tobramicint és közel 40% kanamicin B-t, továbbá 0,1-0,2% N-13- komponenst tartalmazó desztillációs maradékhoz jutunk. Az 59-69. frakciók desztillécióját követően 5,7 g, 0,1-0,15% N-13-komponenst tartalmazó tobramicinhez jutunk. A nyers tobramicint 96%-os vizet etanolból kikristá- 25 lyosítva 4,2 g tiszta tobramicint kapunk. Szabadalmi igénypont Eljárás nebramicin-5’-t (6"-0-karbamoil-tobramicint) tartalmazó fermentlevek előállítására, azzal jellemezve, hogy az új Streptomyces tenebrarius MNG 204 sorszámú törzset vagy ennek egy mutánsát szerves szén- és nitrogén-forrást, szervetlen sókat, nyomelemeket, állati és/vagy növényi olajokat és/vagy zsi-rokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, le-vegőztetett fermentációs körülmények között 33 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 37 °C-on tenyésztjük. Rajz nélkül A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 6 88.78.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
