190454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metiléndifoszfonsav-származékok előállítására
1 190 454 2 tenyésztést mindaddig, amig a csészében lévő sejtszám 5 • 1015 nem lesz. A táptalajt 48 óránként megnyitjuk. Egyhetes tenyésztés után a sejteket tripszin EDTA-vel kezeljük és másodlagos tenyésztésnek vetjük alá. Ezután a sejteket ismét 10% borjúszérumot tartalmazó DMEM táptalajban tenyésztjük tovább mindaddig, amig a sejtszám 2 • 105/16 mm nem lesz. 3 napi tenyésztés után a táptalaj összefolyik. Hashártya makrofágok tenyésztéséhez szükséges táptalaj előállítása Nyúl-hashártya makrofágokat nyerünk az irodalomban leírtak szerint [DESHMUKH-PHADKE és társai, Biochemical Biophysical Research Communication, 85, 490-6, (1978)] Az emberi vér egymagos (mononukleáris) sejtjeit Dayer és társai módszere szerint állítjuk elő és tenyésztjük [The Journal of Immunology, 124, 1712-1720(1980)]. A tenyésztés után a porc-sejteket stimuláló faktort tartalmazó tápközeget elkülönítjük, 0,22 p Millipor szűrő segítségével szűrjük, majd -25 °C hőmérsékletre lehűtjük. Porcsejtek stimutálása A porcsejteket tartalmazó táptalajt összefolyás után DMEN tápközeggel helyettesítjük (ez 1% magzati borjú-szérumot tartalmaz) majd 20%, a porcsejteket stimuláló faktort tartalmazó táptalajjal hozzuk össze. A vizsgálandó vegyületeket a stimuláló anyagot tartalmazó táptalajjal együtt adjuk a táptalajhoz olyan koncentrációban, amely még nem citotoxikus, és amely koncentrációban a vizsgált anyag oldatban van. 3 napig tartó tenyésztés után a táptalajt feldolgozzuk és megállapítjuk a semleges proteináz tartalmát. Semleges proteináz-tartalom meghatározása A vizsgálatot VÉS és társai szerint [Biochemical Journal, 172, 261, (1978)] végezzük. A kapott eredményeket a 7. táblázat foglalja össze; az eredményeket a vizsgálati vegyületekkel kezelt, stimulált porcsejtek által kiválasztott semleges proteináztermelés inhibitálásra vonatkozóan %-ban fejezzük ki. Az eredményeket a vizsgálati anyaggal nem kezelt, de stimulált porcsejtek által termelt proteináz tartalommal hasonlítjuk össze. 7. táblázat In vitro-vizsgálatok eredménye Vizsgált vegyületek kódszáma porcsejtek inhibitálása %-ban vizsgált vegyületek kódszáma porcsejtek inhibitálása %-ban SR 41 036 72 ±8 SR 41 319 85 ± 1 SR 41 100 20 ± 1 SR 41 179 75 ±7 SR 41 421 97 ±2 SR 41 264 50± 10 SR 41 457 95 ±3 SR 41 263 90± 1 SR 41 453 40±2 SR 41 480 56 ±9 SR 41266 68 ±8 SR 41 481 74±9 SR 41 344 31 ±6 SR 41 177 69 ±4 SR 41 482 83±6 SR41 342 99 ± 1 7. táblázat (folytatás) Vizsgált vegyületek kódszáma porcsejlek inhibitálása , %-ban ' vizsgált vegyületek kódszáma ( porcsejtek inhibi látása %-ban SR 41 456 98 ±2 SR 41 388 90 ± 1 SR 41 908 82 ±2 SR 41 960 55 ±4 SR 41 689 90 ± 3 SR 41 690 97± 1 SR 41 688 94 ± I SR 41 249 92 ±4 SR 41 549 58 ±4 SR 41 687 89 ± 2 SR 41 527 54±3 SR 41 959 79 ±2 SR 41 625 92 ±0 SR 42 099 50 ±5 (E) képletű ismert vegyület 3±0,5 nárium sója In vivo vizsgálat Adjuváns arthritis Mycobaktériumot injektálunk patkányba, ez polyarthitist idéz elő, amely bizonyos tekintetben emlékeztet a humán reumás ízületi gyulladásra. Vizsgálat menete Mycobaktérium tuberculosis szuszpenzióját [0,4 mg/(0,05 ml) gyógyászati paraffin] injektálunk intradermálisan hím Sprague-Dawley fajtájú patkányok farkába; a patkányok átlagos súlya 150 g. 15 nap eltelte után elkülönítjük azokat az állatokat, amelyeknél legjobban mutatkoznak az arthritis szimptomái. Ezeket a patkányokat 5-ös csoportokra osztjuk, majd minden egyes csoportot a vizsgálati vegyülettel kezelünk szubkután, 10 mg/kg napi dózissal hetente 6 napon keresztül. A csoportok egyikének csak oldószert adunk, e csoport öszszehasonlítás céljára szolgál. 3 hét eltelte után az állatokat elpusztítjuk, az állatok jobb hátsó mancsát a sípcsonti ízületről leválasztjuk és megmérjük. Minden egyes csoportban megállapítjuk a mért súly középértékét és az átlagos eltérést. A vizsgált vegyületek hatását %-ban fejezzük ki, megadva a százalékos eltérést a vizsgálati vegyületekkel kezelt arthritiszes patkányok mancs-átlagsúlya és az összehasonlítás céljára alkalmazott állatok mancsának átlagsúlya között. A vizsgálati eredményeket a 8. táblázat foglalja össze. 8. táblázat In vivo vizsgálatok eredménye Vizsgált vegyületek kódszáma Adjuvans aktivitás mancssúly inhibitálás %-ban Vizsgált vegyület kódszáma adjuváns arthritis mancssúly inhibitálás %-ban SR 41 036 23 SR 41 319 29 SR 41 100 37 SR 41 452 15 SR 41 421 55 SR 41 272 25 SR 41 454 33 SR 41 179 25 SR 41 453 58 SR 41 264 43 SR 41 266 29 SR 41 263 19 SR 41 344 35 SR 41 273 39 SR 41 388 42 SR 41 552 36 SR 41 482 41 SR 41 689 31 SR 41 690 35 SR 41 319 35. 10 15 20 25 30 '35 40 45 50 55 60 65 11
