190348. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoz-izomeráz előállítására
1 190 348 2 tum-micélium színtelen, a levegő-micélium szürke satírozásával. Zab-agar táptalajon : szaporodása mérsékelt, a levegő-micélium szürke, a szubsztrátum-micélium színe borvörös. Paradicsom-agar táptalajon: szaporodása kedvező, a levegő-micélium szürke, a szubsztrátummicélium színe sötétdrapptól terakottáig terjed. Ólom-acetát-agar táptalajon: szaporodása gyenge, a levegő-micélium barna, a szubsztrátum-micélium színtelen, a levegő-micélium szürke árnyalatával. Vas-pepton-agar táptalajon: szaporodása kedvező, a levegő-micélium szürke, a szubsztrátum-micélium színtelen, a levegő-micélium szürke árnyalatával. Élesztő-maláta-agar táptalajon: szaporodása mérsékelt, a levegő-micélium szürke-egérszürke, a szubsztrátum-micélium sötét-krémszínű. A törzs tűrőképessége (toleranciája) nátriumkloriddal szemben: a táptalajban fennálló nátriumklorid koncentrációval szemben tolarenciája csekély: a maximális koncentráció 4%. E koncentráció mellett a törzs szaporodása gyenge, a levegő-micélium világoskék, a szubsztrátum-micélium sötétkék. Ha a nátrium-klorid koncentrációja 2%-nál nagyobb, akkor ennek a spóraképzésre negativ hatása van. A törzs a zsírtalanított tejet koagulálja; a zselatint nem folyósítja el. Szaccharóz táptalajon kedvezően szaporodik, a szaccharózt azonban nem hasznosítja. Keményítő-agaron nagyon kedvezően szaporodik, és jól hidrolizálja a keményítőt. A cellulózt nem bontja el, a nitrátokat nitritekké redukálja, kénhidrogént választ el. Burgonyán szaporodni képes. Hemolízis-negatív, tirozináz-pozitív, meianoidokat képez. Pridham-Gottlieb-féle alaptáptalajon kedvező szaporodás figyelhető meg a következő szénforrásokkal: glükóz, fruktóz, laktóz, levulóz, xilóz, mannóz, cellobióz, galaktóz, mannit, inozit, arabinóz, dextrin, ribóz és glicerin. A szalicint gyengén adszorbeálja. Szorbitot, szaccharózt és raffinózt tartalmazó táptalajon nem szaporodik. A szénforrástól függően különbségek figyelhetők meg a levegő- és szubsztrátum-micélium pigmentálódásában. A Pridham-Gottlieb-féle módosított alaptáptalajon a törzs kedvezően szaporodik a következő nitrogénforrások jelenlétében: ammónium-klorid, ammónium-szulfát, di-ammónium-hidrogén-foszfát, ammónium-dihidrogén-foszfát és karbamid. Ammónium-nitrátot és dinátrium-hidrogénfoszfátot tartalmazó táptalajon a törzs mérsékelten, nátrium-nitrátot és nátrium-nitritet tartalmazó táptalajon egyáltalában nem szaporodik. A törzs nagyon kedvező szaporodása figyelhető meg a következő aminosavakat tartalmazó táptalajokon: glutaminsav, aszparaginsav, alanin, valin és aszparigin. A törzs mérsékelten szaporodik olyan táptalajokon, amelyek leucint, cisztint, prolint, hidroxi-prolint, fenil-alanint és tirozint tartalmaznak. A nitrogénforrástól függően a levegő- és szubsztrátum-micélium pigmentálódásában különbségek figyelhetők meg. Egyes ismertetőjelei szerint a 765. számú Streptomyces-törzs hasonló a Streptomyces coelicolor törzshöz, amely a Bergey-féle (1974) Gray-sorozathoz (az N. A. Krassilnikow szerinti Coelicolorcsoport Actinomyces coelicolor tagja - 1970) tartozik. Ez utóbbi egyes tenyészeti-alaktani és fiziológiai-biokémiai sajátosságaiban különbözik, melyeket a Bergey-féle (1974) és N. A. Krassilnikow-féle (19701 species jellemzés ír le. így például a Streptomyce: coelicolor a spirálisain 1-3 gyűrűcskét visel, a zsel itint lassan elfolyósítja, a zsírtalanított tejet pepto lizálja és tirozináz-negatív. Ennek alapján a 765. s íámú Streptomyces-törzs a hasonló Streptomyce: coelicolor (Actinomyces coelicolor) törzzsel nem í zonos , s ezért a Bergey-féle Gray-sorozathoz (1974) és az N. A. Krassilnikow szerinti Coelicolorcsoporthoz (1970) soroljuk. A termelő törzset 50 ml fermentációs táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban, 36-96 órán át, 24-36 °C hőmérsékleten, kezdeti 6,5-9,0 pH érték mellett, percenként 180-320 fordulatszámú rázógépen tenyésztjük. A glükóznak fruktózzá való átalakítása (konverziója) a 765. számú Streptomyces-törzsből származó glükóz-izomeráz segítségével a következőként végezhető : a friss micéliummal való közvetlen kezelés útján (ezt a micéliumot 12 000 percenkénti fordulatszámú centrifugálással és 0,05 mólos, 7,0 pH értékű foszfát-pufferral való háromszori öblítéssel választjuk le); vagy a szárított micéliummal (légszáraz vagy acetonnal szárított sejtek); vagy olyan enzimoldattal, amelyet a sejttömeg ultrahanggal vagy autolízissel végzett elbontásával és a felülúszó percenként 15 000 fordulatszámú centrifugálással való leválasztásával állítunk elő; valamint az extracelluláris izomerázt tartalmazó tenyészet centrifugált termékével ; vagy a szilárd hordozón immobilizált sejtek segítségével. A reakcióelegyben képződött fruktózt a ciszteinkarbazol eljárással [J. Biol. Chem. 192, 583 (1951)] határozzuk meg, és a törzs aktivitását a kultúrafolyadék 1 milliliterében lévő fruktóz milligrammos mennyiségével vagy nemzetközi glükóz-izomeráz egységekben (GIU) fejezzük ki. A GIU az enzimnek az a mennyisége, amely 70 °C hőmérsékleten, 7,0 pH érték mellett, 1 mólos glükóz-oldatban, 0,05 mólos foszfát-pufferban, 2 10“2mól MgS04 • 7 H20 jelenlétében 1 perc alatt 1 gmól glükózt 1 pmól fruktózzá alakít. A találmány szerinti eljárás előnyei a következők. A 765. számú Streptomyces-törzs a glükózizomeráz enzimet a táptalajban kobaltionok nélkül termeli. Az így képződött enzim a D-glükózt D- fruktózzá alakítja akkor is, ha az izomerizáló elegyben kobaltionok nincsenek jelen : ennek következtében a technológiai folyamat lényegesen egyszerűbbé válik, és nem szükséges ioncserélő rendszerek alkalmazása a kobaltnak fruktózt tartalmazó szirupokból való leválasztására. A szabadalmi irodalomból ismert, glükóz-izomerázt termelő mikroorganizmus-törzsekkel és mutánsokkal összehasonlítva - amelyek a tenyésztő táptalajokban és izomerizáló elegyekben kobaltionok jelenlétét nem igénylik (1 411 763., 1 411 764. és 1 411 765., továbbá 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 65 4
