190348. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoz-izomeráz előállítására
1 100 348 2 A találmány tárgya eljárás glükóz-izomeráz Streptomyces-törzsből való előállítására. Ismeretes, hogy a D-glükóz D-fruktózzá alakulása a gliikóz-izomeráz enzim hatására valósul meg. A D-fruktózt az élelmiszeriparban és a fogyasztási Cikkeket előállító iparban, továbbá a fejlett országok diétás élelmezésében egyre kiterjedtebben használják. Keményítőlebontó enzimek (aamiláz. és glükoamiláz) komplexével kombinálva a gliikóz-izomeráz lehetővé teszi glükóz-fruktózszirupok keményítőből való közvetlen előállítását. Gliikóz-izomeráz előállítására alkalmas eljárások 1957 óta ismeretesek: ekkor mutatták ki első Ízben, hogy D-glükóz a 491. és 492. számú Pseudomonas hydrophyla baktériumtörzs sejtjeinek segítségével közvetlenül D-fruktózzá konvertálható. A gliikóz-izomeráz előállításának céljára legtöbb esetben Streptomyces-törzshöz tartozó mikroorganizmusokat alkalmaztak. Mindmáig a glükózizomeráz bioszintézis elengedhetetlen feltételének tartják, hogy a tenyésztésre szánt táptalajokban különböző ásványi sóknak kell jelen lenni. Az irodalomban és szabadalmi leírásokban közölt táptalajok magnéziumsóként MgS04 ■ 7 H20-t, kobaltsóként CoCl2 • 6 H20-t tartalmaznak [Agr. Bioi. Chem. 25, 272 (1961)]. A táptalajokba a tenyésztés céljából beágyazott sók koncentrációja az enzimtermelő mikroorganizmus jellegétől függ; MgS04 ■ 7 H20 esetében többnyire 0,02-0,5%, CoCl, • 6 H20 esetében 0,005-0,024% között váltakozik' [Appl. Microbiol. 30, 1247 (1966)]. Egyes Streptomyces-fajok alkalmazása során - még akkor is, ha az aktiválás céljából magnéziumionokat adagolnak - a kobaltionok jelenléte abszolút módon szükséges a glükóz-izomeráz képződéséhez [Appl. Microbiol. 21, 588 (1971); Academic Press Inc. 1969, 561; Agr. Bioi. Chem. 31, 902 (1967)]. Állandóan folyik a kutatás olyan, glükóz-izomerázt termelő törzsek és mutánsok felfedezése céljából. amelyek akkor is képesek kielégítő hozammal enzimet termelni, ha a tenyésztéshez alkalmazott táptalajban kobaltionok nincsenek jelen. Ismeretesek a CIC International Inc. mutánsai (1 411 763., 1411 764. és 1 411 765. számú nagy-britanniai szabadalmi leírások) és olyan Artrobacter-fajok ( 1 328 970. és 1 362 365. számú nagy-britanniai szabadalmi leírások), amelyek nem igénylik kobalt jelenlétét a glükóz-izomeráz bíoszintéziséhez. Ha glükózoldatokhoz az izomerizálás során kobalt- és magnéziumionokat adunk, akkor ez az enzimaktivitást ugyanolyan erősen befolyásolja. Kimutatták, hogy ezek a fémek az enzim kofaktorai. tehát a glükóz-izomeráz a fémenzimek közé sorolható [Agr. Bioi. Chem. 35,997 (1971)]. Megállapították, hogy az YT 5,4 számú Streptomyces-faj gliikóz-izomeráz enzim egy molekulája 1 kobaltatomot és 33 magnéziumatomot tartalmaz. Feltételezik [Agr. Bioi. Chem. 35, 977 (1971)], hogy a magnézium és kobaltion glükóz-izomerázzal alkotott vegyülete az enzim aktív formájának kialakulásához szükséges. Hasonlóképpen azt is feltételezik, hogy e folyamat során az enzim konformációja megváltozik. Egyes szerzőknek az a véleménye, hogy kobaltionok - különösen magnéziumionok-7 kai együttes - bevitelének hatására a glükóz-izomeráz enzim hőstabilitása lényegesen megnő [Agr. Bioi. Chem. 35, 997 (1971); Appl. Microbiol. 29, 745 (1975)]. Nagyobb mennyiségű kobaltion jelenléte a fruktóz-szirupokban nem kívánatos [Arch. Pediat. 78, 200 (1961)], annak ellenére, hogy kobaltionok nyommennyisége szükséges az ember táplálkozásához (1411763., 1411764. és 1411765. számú nagy-britanniai szabadalmi leírások). A fruktózszirup kobaltion-tartalma körülbelül 1 millimól (3 623 953. számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); kimutatták azonban, hogy ez a koncentráció patkányokon határozottan toxikus jelenségeket idéz elő [Arch. Biochem. 27, 34 (1950)]. Abból a célból, hogy az izomerizálási folyamat befejeződése után a glükóz-fruktóz-szirupokból a kobaltionokat eltávolítsák, a szirupokat a maximális mértékű leválasztás céljából ioncserélő gyantákkal kell feldolgozni. Ez a kiegészítő folyamat ipari méretű, automatizált ioncserélő rendszerek létesítését igényli. A Mi-Car International cég teljesen automatizált ioncserélő rendszereket alkalmaz, amelyek a kation-anion-részek két szektorával (erősen savas Duolite C 25-D kationcserélő és Duolite S-56 gyengén alkálikus anioncserélő gyanta) működnek. Ez az ioncserélő rendszer savakkal vagy bázisokkal végzett, szakaszos regenerálást és nagy mennyiségű, tiszta vizet igényel. Abból a célból, hogy az ioncserélő rendszerrel feldolgozott glükóz-fruktózszirupokban a kobaltionok mennyiségét ellenőrizzék, automatizált abszorpciós spektrofotométerrel végeznek vizsgálatot úgy, hogy az áramló szirupból folyamatosan mintát vesznek, és ennek alapján szabályozzák a kationcserélő rendszer működését. E feldolgozás során a kobaltionokat 5 ppb (rész/billió rész) koncentrációig 25% S mellett el kell távolítani [Isomerized Syrup Process; MFG Information (Mi-Car International Inc.) (1975)]. Ez a folyamat az előállítást megnehezíti, és mind a hatékonyságra, mind az önköltségre negatív hatással van. A találmány célja olyan eljárás biztosítása glükóz-izomeráznak termelő törzsből való előállítására, amely az enzim bioszintéziséhez, valamint a D-glükóz D-fruktózzá való izomerizálási reakciójához kobaltionokat nem igényel, és ennek következtében gazdaságossági eredményt jelent. A glükóz-izomerázt termelő 765. számú Streptomyces sp. törzset bulgáriai talajokból izoláltuk. E felfedezés céljából 874 Streptomyces-törzset vizsgáltunk meg. A szűrővizsgálatot (screenelést) az 1. számú Krassilnikow-féle, módosított szintetikus táptalajon végeztük, és ennek során a kiválasztást két szubsztrátumszinten, xilóz és xilán alkalmazásával hajtottuk végre. E körülmények között 18 olyan Streptomices-törzset fedeztünk fel, amelyek lehetőséget nyújtottak a fejlesztésre és a glükózizomeráz enzim termelésére; ezek közül a 765. számú Streptomices sp. képesnek bizonyult arra, hogy tenyésztő táptalajon kobaltionok hiányában is glükóz-izomerázt termeljen. E törzset az NDK-ban az Állami Gyógyszerellenőrző Intézetben (Staatliches Institut für Kontrolle der Arzneimittel) 1979. szeptember 29-én le-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
