190347. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükoz-izomeráz előállítására
1 190 347 2 A szénforrásoktól függően különbségek figyelhetők meg a lég- és szubsztrátmicéliumok elszíneződésében. Egy Pridham és Gottlieb-féle modifikált alaptápközegben a törzsek igen jó fejlődését állapítottuk meg az alábbi nitrogénforrásokkal: NH4C1, (NH4)2S04, (NH4)2HP04, NH4H2P04, nh4no3, Na2HP04 és karbamid, A törzs mérsékelt fejlődést mutat NaN03 tartalmú tápközegben. NaN02 tartalmú tápközegben ez a törzs nem növekszik. Megfigyelhető, vagyis megállapítható, hogy a törzs nagyon jól növekszik az alábbi aminósavas tápközegekben: aszparaginsav, aszparagin, prolin, eisztin, tirozin. Mérsékelt növekedést mutat a törzs valin, hidroxiprolin, fenilalanin, leucin, alanin tartalmú tápközegekben. A törzs glutaminsavas tápközegben nem fejlődik. A nitrogén források függvényében különbségek mutatkoznak a lég- és szubsztrátmicéliumok színeződésében. Az 1339-es számú Streptomyces-törzs hasonló egyes tulajdonságok tekintetében a Streptomyces griseoflavushoz, amely a Bergey's-féle (1974) Grayszériához - az N. A. Krassilnikow - 1970-szerinti Flavus-csoport Actinomyces griseoflavusához tartozik. Ez utóbbi egy sor kultúra-morfológiai és fiziológiai-biokémiai tulajdonságban különbözik, melyek a Bergey's ^ 1974) és N. A. Krassilnikow ( 1970)-féle Species-jellemzőkben vannak leirva. A Streptomyces griseoflavusnak például hosszúkás. pálcika alakú és ovális, fényes felületű spórái vannak, NaCl-dal szemben 7-10%-os toleranciát (tűrést) mutatnak. A keményítőt gyengén hidrolizálja. A szacharózt és a szorbitot abszorbeálja, de a galaktózt nem. Következésképpen az 1339-es számú Streptomyces-törzs nem azonosítható a hozzá közelálló Streptomyces griseoflavussal (Actinomyces griseoflavus), s ezért ezt a Bergey's-féle Grayszéria (1974) és az N. A. Krassilnikow-féle Flavuscsoport (1970) 1339-es számú Streptomycesének tulajdonítjuk, A termelő törzset 50 ml fermentációs tápközeget tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 36-96 óra alatt, 24-36 °C hőmérsékleten, a kultiválás kezdetén 6,5-9 közötti pH-értéken, egy 180-320/perc fordulatszámú rázógépen kultiváljuk. A glükóz fruktózzá történő átalakítását az 1339-es számú Streptomyces-törzsből képződő glükóz-izomerázzal előállíthatjuk direkt kezelés útján friss micéliummal (melyet 12 000 fordulat/perces centrifugálással kicsapattunk és 0,05 M-os, 7,0-es pH-értékű foszfátpufferrel háromszor átmostunk) vagy szárított micéliummal (légszárítású vagy acelonszárítású sejtek); enzimes oldattal, melyet a sejtanyag ultrahanggal vagy autolízissel történő bontása és a szupernatánsoktól 15 000 fordulat/perces centrifugálással történő elkülönítése útján állítunk elő; vagy centrifugátum tenyészettel, mely extra sejtekből álló izomerázokat vagy szilárd hordozón immobilizált sejteket tartalmaz. A reakcióelegyben képződött fruktózt a ciszteinkarbazol-eljárás szerint határozzuk meg (Dische Z., Borenfreund E. 1951. J. Biol. Chem., 192, 583), a törzsaktivitást mg fruktóz/ml tenyészfolyadékban vagy nemzetközi glükóz-izomeráz-egységben (GIU) adjuk meg. Ebben az esetben egy GIU az az enzimmennyiség, mely 70 °C-on, 7,0 pH értéknél, 1 M glükózoldatot, 1 • 10“4 M CoCI2 ■ 6H20-t és 1 • 10-2 M MgS04 • 7H20-t tartalmazó 0,05 M-os foszfátpuflferben 1 perc alatt 1 pmol glükózt 1 pmol fruktózzá átalakít. A találmány szerinti eljárás előnyei a következők: a glükóz-izomeráz előállítására az 1339-es Streptomyces-törzset használjuk, mely az enzim nagy bioszintetikus lehetőségeit mutatja (12 000-20 000 GIU/1), mely 4-20-szorosan meghaladja a szabadalmi irodalomban ismert termelő törzsek aktivitását, (3 616 221-es számú amerikai szabadalom; 3 834 988-as számú amerikai szabadalom; 1 376 787-es számú angol szabadalom; 1 451 273-as számú angol szabadalom; 1 284 218- as számú angol szabadalom; 534 490-es számú szovjet szabadalom ; 534 491 -es számú szovjet szabadalom; 542 763-as számú szovjet szabadalom; 2 119 713-as számú nyugatnémet szabadalom; 2 247 922-es számú nyugatnémet szabadalom ; 2 018 518-as számú nyugatnémet szabadalom ; 1 934 461-es számú nyugatnémet szabadalom.) Az így kapott enzimet magas hőmérsékleti optimum (70 °C), az izomerizációs elegyben a Co+ + (1 • 10 4 M)ésMg++ (1 • 10“2 M) kis optimumkoncentrációja, kedvező pH-optimum (7,0) és 40-65 °C között jelentős hőmérsékleti stabilizáció jellemzi. A találmányt az alábbi példák segítségével mutatjuk be: /. Példa A termelő törzset kémcsövekben kedvező agaragaron tartjuk, a tápközegek az alábbi összetételűek: 1. Xilóz-tápközeg: xilóz 20 g, agar-agar 20 g, KN03 1,0 g, K2HP04 0,5 g, MgS04 • 7H20 0,5 g, NaCl 0,5 g, CaC03 1,0 g, FeS04 0,001 g és víz 1 literre való feltöltéséig. 2. Burgonya-glükóz-agar-agar: burgonyakivonat 300 g főtt burgonyából, glükóz 10 g, agar-agar 20 g és víz 2 1-re való feltöltésig. Előnyös a törzsek megőrzése érdekében a két tápközeget felváltva használni. Az 1-es vagy 2-es tápközegben (előnyösebb az 1-es) lévő 10-15 napos tenyészet jól fejlett anyagához 6 ml, alábbi összetételű inokulációs tápközeget adunk: xilóz 1,0%, tripton 2,0%, MgS04 • 7H20 0,1%, K2HP04 0,25%. Végezetül a sejtmassza leöblítése következik, amelynél a kémcsövet egy rázógépen 24 órán keresztül, 30 °C-on 240 fordulat/perc sebességgel mozgatjuk. Az ily módon keletkezett tenyészetet a következő összetételű inokulációs közegbe helyezzük: xilóz 1,0%, kukoricakivonat 3,0% (szárazanyagnak megfelelően), MgS04 • 7H20 0,1%, K2HP04 0,25%, agar-agar 0,1%. A fent ismertetett feltételek szerinti 60 órás kultiválás ufán a fermentációs tápközeget az alábbi öszszetételű 5%-os inokulummal oltjuk be: xilóz 1,0%, kukoricakivonat 3,0% (szárazanyagnak megfelelő-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
