190340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az aktaplanin pszeudo-aglikonh-származékának előállítására
1 190 340 2 A beoltott fő fermentációs táptalajt 24 órán át 30 *C hőmérsékleten, egy percenkénti 250 fordulatszámú forgó rendszerű rázóasztalon rázatjuk. - Ezután e fő fermentációs táptalaj 0,8 ml-nyi részleteivel beoltjuk az alábbi összetételű, második inokulum táptalaj 100-100 ml-nyi részleteit, amelyeket 500 ml-es Erlertmeyer-lombikokban félórán át 121 *C hőmérsékleten sterileztünk. összetevő Mennyiség cerelóz 1,25% kukoricakeményítő 4,4% szaccharóz 3,75% melasz 2,0% élesztő 1,25% Proflo (gyapotmag olaj)* 1,25% kalcium-karbonát 0,25% dikálium-hidrogén-foszfát 0,625% ammónium-szulfát 0,031% Sag 471 0,03% * = Traders Protein Division, Traders Oil Mill Company, P.O.Box 1837, Fort Worth, Texas 76 101. A fenti beoltott táptalaj-mennyiségeket körülbelül 96 órán át 30 *C hőmérsékleten, percenként 250 fordulattal működő forgó rendszerű rázóasztalon rázatjuk. Ezen időszak végén a közeg pH-ja körülbelül 8,0. ' b) lépés Tenyésztés 40 literes tartály fermentorban Az inokulumot a fenti a) lépésben leírt módon, a fő fermentációs táptalaj beoltásával és inkubálásával állítjuk elő. 25 liter fent leírt második inokulum táptalajt autoklávban félórán át 121 *C hőmérsékleten sterilezünk, majd egy 40 literes térfogatú fermentációs tartályba töltjük. Ezután hozzáadunk 100 ml beoltott fő fermentációs táptalajt, és a tenyésztést 4 napig 30 *C hőmérsékleten végezzük. A közeget eközben steril levegővel levegőztetjük, a levegő mennyisége a táptalaj térfogategységére vonatkoztatva, percenként fél térfogategység. A táptalajt egy megfelelő méretű és fordulatszámú keverővei keveijük, hogy a levegő megfelelően eloszoljék a táptalajban. A táptalaj pH-ja a kezdeti, körülbelül 6,5-ös értékről a tenyésztés végére körülbelül 8,0-ra növekszik. c) lépés Az A-4696 jelzésű antibiotikum-komplex elkülönítése A fentiek szerint kapott fermentációs közeghez (3800 liter) hozzáadunk 5 vegyes százaléknyi Celite 545 jelzésű szűrési segédanyagot, majd az elegyet megszüljük. A kiszűrt anyagot ionmentesített vízben (3600 liter) újra felszuszpendáljuk, és a vizes szuszpenzió pH-ját vizes nátrium-hidroxid-oldat segítségével 10,5-re állítjuk. A szilárd részeket kiszűrjük és vízzel mossuk. Az egyesített szürletet és mosófolyadékot 20 vegyes százalékos, vizes kénsawal pH = 4,5-re savanyítjuk. A savas oldatot 1%-nyi mennyiségű szűrési segédanyaggal (Celite 545) derítjük. A tiszta oldatot átfolyatjuk egy 5 1,8 x 5 láb méretű, 350 liter, nátrium-formában lévő Amberlite IR-116 ioncserélő gyantával töltött oszlopon, majd az oszlopot 1200 liter ionmentesített vízzel mossuk. Az IR-116 gyantát kiszedjük az oszlopból, és szakaszosan, 10,5-ös pH-nál vizes 10 nátrium-hidroxid-oldattal eluáljuk. (összesen: 1000 liter.) Az elutumot 20 vegyes százalékos, vizes kénsavval pH = 7-re semlegesítjük, majd háromszor 50 ml ionmentesített vízzel kimossuk a gyantát. A vizes mosófolyadékokat szintén semlegesit- 15 jük, és egyesítjük a semlegesített elutummal. A kapott oldatot betöményítjük, majd a sűrítményt fagyasztva szárítjuk. Az így kapott nyers komplex színe drapp és sötétbarna között változik. 20 d) lépés A sók eltávolítása a nyers A-4696 jelzésű antibiotikum-komplexből 1,0 kg nyers komplexet lassan, részletekben, eré- 25 lyes keverés közben hozzáadunk 1,5 liter ionmentesített vízhez. A szuszpenziót 20 percig keverjük, majd 10%-os, vizes ammónium-hidroxid-oldattal pH = 7-re semlegesítjük. A megszárított, sómentesített komplexet a nyers komplexre számítva körül- 30 belül 80%-os hozammal nyerjük vissza (a biológiai értékmérés alapján). e) lépés A sómentesitett A-4696 jelzésű 35 antibiotikum-komplex tisztítása 300 g megszárított, sómentesített komplexet 2 liter ionmentesített vízben szuszpendálunk, és a szuszpenzió pH-ját 3 normál vizes sósavval 2,7-re 40 állítjuk. A megsavanyított oldatot 40 percen át 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót leöntjük, és felvisszük egy 8 x 85 cm méretű, 6 liter derítő gyantával (Duolite S761) töltött oszlopra. Az aktív anyagot 30 ml/perc sebességgel, 45 ionmentesített vízzel eluáljuk. Az eluciót vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel követjük. Az A- 4696 jelzésű antibiotikumot tartalmazó elutumot 3 mm nyomáson, 35 *C hőmérsékleten, 3 liter térfogatra betöményítjük, majd a sűrítményt fagyasztva 50 szárítjuk. A derítési műveletben a fehér és drapp közötti színű komplexet körülbelül 70% hozammal nyeljük vissza (a biológiai értékmérés alapján). 55 f) lépés Az A-4696 jelzésű antibiotikum egyes összetevőinek elkülönítése 10 g megszárított, derített A-4696 jelzésű antibiotikum-komplexet feloldunk körülbelül 100 ml 60 desztillált vízben. A vizes oldatot megszűrjük, és felviszzük egy fordított fázisú adszorbenssel, például Li ChroprepR RP-18* adszorbenssel töltött oszlopra, és az oszlopot trietil-amin-foszfátot tartalmazó, vizes acetonitrillel, gradiens elucióval mossuk. A szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy az ace-7
