190207. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új gonadoliberin származékok előállítására
1 190 207 2 A védőcsoportokat tartalmazó végterméket hidrogén-fluoridos hasítással és/vagy etil-ammonolizissel előnyös eltávolítani a gyantáról. A b) változat szerinti kombinációk közül az alábbi változatok különösen előnyösek: valamely (II) képletű Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II) pentapeptid-azidot valamely (III) általános képletű X,-X2-X3-Pro-X4 (III) tetra- vagy pentapeptiddel kondenzálunk. A fenti (III) képletben X,, X2, X3 és X4 jelentése a fenti. A képződött nona-, illetve dekapeptid-amidot kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható savval reagáltatva savaddíciós sóvá alakítjuk, vagy kívánt esetben a savaddíciós sóból bázissal reagáltatva felszabadítjuk a szabad bázist. A találmány tárgya továbbá eljárás az (I) általános képletű vegyületekből halak szaporítására alkalmas kompozíciók előállítására. Ezt az eljárást úgy végezzük, hogy valamely (I) általános képletű vegyületet vagy annak savaddíciós sóját szokásos hordozó- és/vagy vivöanyagokkal összekeverve halak szaporítására alkalmas kompozicióvá alakítjuk. Az (I) általános képletű gonadoliberin származékok halakban intramuszkuláris vagy szubkután injekcióval bevíve 0,1 pg-5 mg dózistartományban hatékonyak. A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy a segitségével előállított új gonadoliberin-származékok a 7-es és 8-as helyzetben új aminosavkombinációkat tartalmaznak, és kedvezően alkalmazhatók halak szaporítására. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. Az 1-4, 6-7 és 9-12 példákban a vegyületeket a szilárd fázisú szintézis általánosan alkalmazott módszereivel (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2151 /1963/) állítottuk elő. A kívánt vegyüld szerkezetétől függően peptid-alkilamid esetén klór-metilezett polisztirol-divinil-benzol, peptid-savamid esetén pedig benzhidrilamin gyantából indultunk ki. Az egyes aminosavakat lépésenként kapcsoltuk a gyantához N-t-butil-oxi-karbonil (Boc) származékaik formájában diciklohexilkarbodiimid (DCC), illetőleg diizopropil-karbodiimid (DIC) segítségével vagy aktív észteres kapcsolással. A kapcsolási reakciók lejátszódásának mértékét ninhidrin teszttel (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal. Biochem. 34, 595-598 /1970/) vizsgáltuk. Szabad amino-csoport detektálása esetén az acilezést megismételtük. A kapcsolások időtartama az aminosavaktól függően 1 és 16 óra között változott. A védőcsoportok eltávolítását és a peptid lehasítását a gyantáról egy lépésben végeztük, folyékony vízmentes hidrogén-fluoriddal (Sakakibara S., Shimonishi Y., Kishida Y., Okada M., Sugikara H., Bull. Soc. Japan. 40, 2164-2167 /1967/). Nim-dinitrofenil alkalmazása esetén a védőcsoportot még a HF-os hasítás előtt távolítottuk el. A védett peptidgyantát propilamin tartalmú dimetil-formamidban kevertük, majd az oldószer eltávolítása után a peptidgyantát propilamin tartalmú dimetil-formamidban kevertük, majd az oldószer eltávolítása után a peptidgyantát HF-dal a szokásos módon kezeltük. Peptid-alkil-amid típusú vegyület esetén a pepiidet a gyantáról alkil-ammonolízissel távolítottuk el, majd a védőcsoportok természetétől függően katalitikus hidrogénezést és/vagy savas hidrolízist alkalmaztunk. A HF-os hasítás után kapott nyers terméket gélszűréssel tisztítottuk, Sephadex G25 oszlopon, eluensként ecetsavas oldatokat alkalmazva. További tisztításokat preparatív HPLC oszlopon és/vagy szilikagél kromatográfiával végeztünk. A peptidek tisztaságát aminosavanalízissel és TLC- vel vizsgáltuk. A vékonyrétegkromatográfiás Rr értekeket Kieselgel (DC Alufolien, Merck) lemezeken az alábbi oldószerelegyekben határoztuk meg: 1 Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 30:20:6:11 •2 Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 60:20:6:11 3 Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 120:20:6:11 4 Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 240:20:6:11 5 n-Butanol-ecetsav-víz-etilacetát 1:1 :ï : 1 6 n-Butanol-ecetsav-víz 4:1:1 7 i-Propanol-1 mól ecetsav 2:1 8 Etilacetát-piridin-ecetsav-víz 5:5:1:3 1. példa [D-Phe6, Gln8]-gonadoliberin előállítása M: 1243 a) Szintézis 1,25 g (1 mmól) benzhidrilamin-HCl gyantát [0,8 mM/g, Pierce] 2 órán át duzzasztunk diklór-metánban, majd az aminosavakkal történő acilezés során a következő ciklust ismételjük: Lépés Reagens, művelet Keverési idő 1. CH2C12, mosás háromszor (perc) 1 2. 33% trifluorecetsav (TFA) és I 67% CH2C12 elegye 3. 33% trifluorecetsav (TFA) és 25 67% CH2C12 elegye 4. CH2CI2, mosás háromszor 1 5. CHC13, mosás kétszer 1 6. 10% trietil-amin- (TEA) és 2 90% CHC13 elegye, mosás kétszer 7. CHC13, mosás kétszer 1 8. Etanol, mosás kétszer 1 9. CH2C12, mosás kétszer 1 10. 3 ekv. Boc-aminosav, CH2C12- ben oldva* 3 ekv. DCC v. DIC CH2CI2-ben oldva 60-változó 11. CH2C12, mosás kétszer 1 12. Etanol, mosás kétszer 1 * Gin kapcsolása esetén Boc-GIn-ONP-vel aktív észteres kapcsolást végzünk; piroglutaminsav esetében nem alkalmazunk védőcsoportot. Minden lépés után ninhidrin-tesztet végzünk; amennyiben pozitív eredményt kapunk, a ciklust az 5. sortól megismételjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
