190141. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavin-tipusú anyarozs-alkaloidok előállítására
7 190141 8 Poliszacharid képzés C-jelû táptalajon a 7. napon elanolos csapadék - képzés alapján- mg/ml 20.8 3.8 Ö88zalkaloid termelés sebessége C-jelü táptalajon a 4-7. napon, pg/ml/nap 50-80 200-250 Alkaloid összetétel C-jelü táptalajon agroklavin % 75-80 5-15 elimoklavin % 20-25 85-95 D-jelű táptalajon agroklavin % 90-95 10-15 elimoklavin % 5-10 85-90 A találmány szerinti eljárással előállított új MNG 00211 számú törzset klavin-tipusú alkaloidok előállítására a kővetkezőképpen alkalmazzuk: A fermentációs eljáráshoz valamely alkalmas folyékony táptalajt használunk, mely szén- és nitrogén-forrást, ásványi anyagokat és adott esetben egyéb adalékanyagot tartalmaz. Az alkaloidtermelő fermentációnál alkalmazható táptalaj-összetételek egyebek között a kővetkezők: „E" - táptalaj: sál az alábbi példákkal szemléltetjük, anél- 20 kül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 25 30 1. példa MNG 00211 számon deponált Claviceps fusiformis variáns törzs 14 napos, „A" táptalajon nőtt ferde agar tenyészetét 5 ml fiziológiás sóoldattal lemossuk. A kapott szuszpenzió 1 ml-ét 500 ml-e8 Erlenmeyer lombikban előkészített 100 ml „C" jelű folyékony táptalajra oltjuk, és a kultúrát 24 ®C-on, mannit 40.0 g/1 körrázógépen (löketszám: 240/perc; löketborostyánkösav 10.0 g/1 hossz: 2 cm) 7 napig inkubáljuk. kukoricalekvár 2.0 g/1 35 Az így készített oltótenyészet 4 ml-ével kálium-dihidrogén-foszfát 1.0 g/1 elindítjuk a termelő fermentációt. Az alkalomagnézium-szulfát pH 5,2-5,3 (NHiOH-dal állítva) 0.3 g/1 idtermelés céljára 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 100 ml „C"-táptalajt sterilezőnk. Azonos körülmények között végzett 12 napos te„F” - táptalaj: 40 nyésztési idő alatt a kultúrához a 3. és 5. szacharóz 50.0 g/1 napon Difco élesztőkivonat 10%-os, steril, vireszelt burgonya 10.0 g/1 zes oldatából 1,0-1,0 ml-t adunk. ammónium-nitrát 1.0 g/1 A fermentáció végén a drappos-lila tekálium-dihidrogén-foszfát 0.25 g/1 nyészet száraz micéliumtartalma 18 g/1, szűrmagnézium-szulfát pH 5,4-5,5 (NH<OH-dal állítva) 0.25 g/1 45 létéből van Urk reakció alapján az össz-alkaloid-tartalom elimoklavin standardre szá„G" - táptalaj: szorbit 60.0 g g/1 borostyánkősav 36.0 g g/1 kálium-dihidrogén-foszfát 0.25 g g/1 magnézium-szulfát 0.30 g g/1 vas(II)-szulfát 0.009 g g/1 cinkszulfát 0.003 g g/1 pH 5,4-5,5 (NHíOH-dal állítva) A felsorolt öszzetételek bármelyikét 50- 60 ®C-on csapvízben oldjuk, majd 110 °C-on 30 percig sterilezzük. A fenti táptalajok bármelyikén vagy „C” táptalajon agar-agar hozzáadása nélkül steril aerob körülmények között alámerülő kultúrában, 20-28 °C hőmérsékleten 4,2-6,0 pH tartományban 10-15 napon át végezzük a fermentációt. A találmány szerinti új törzs alkalmazá-50 molva 1300 pg/ml. A tenyészet alkaloid-komponenseit az alábbi módszer szerint határozzuk meg: 20 ml tenyészetet 40 ml 4:1 arányú kloroform-izopropanol eleggyel 9 pH értékén extrahálunk, és szerves fázisból 10 ml-t vákuumban szárazra párolunk. A bepárlási maradékot 0,5 ml 1:1 arányú kloroform-metanol elegy ben old- 55 juk és az oldatból 20 pl-t vékonyrétegkromatográfiás módszerrel analizálunk. TAdszorbens: DC Alufolien Kieselgel 60Fis« (Art 5554); futtató elegy: kloroform-etanol 4:1 arányú elegye; előhívás: 254 nm-es UV-fényben; elimoklavin: Rf=0,20; agroklavjn: R/=0,30]. Az alkaloidot az adszorbensról 10- 10 ml borkŐ8av-metanol eleggyel leoldjuk és az oldat abszorpcióját 283 nm-en vakoldattal szemben mérjük. A 12 napos tenyészet így g5 meghatározott elimoklavin tartalma 60 5
