190141. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavin-tipusú anyarozs-alkaloidok előállítására
3 190141 4 A találmány tárgya új eljárás az I általános kápletű klavin-típusú anyarozsalkaloidok fermentativ úton való előállítására új Claviceps fusiformis variáns törzs alkalmazásával. Az I általános képletben R hidroxi-metilcsoportot (elimoklavin) vagy metilcsoportot (agroklavin) jelent. Az előállitott alkaloidok közűi az elimoklavin az értékesebb, mely analeptikus és antiparkinzon hatású, valamint gátolja a prolaktin szekréciót [B. Berde és O.Schild: Ergot Alkaloids and Related Compounds; Handb. Exp. Pharm., 49. Spriger Verlag, Berlin (1978) ] Az elimoklavin továbbá a lizergol, valamint az ebből előállítható Nicergolin kiindulási anyaga illetve intermedierje is. Ismeretes, hogy a növényparazita Claviceps gombák gazdanövényükkel szimbiózisban anyaroz8alkoloidok bioszintézisére képesek. A klavln alkaloidokat termelő Claviceps törzsekről korán ismert volt, hogy a jellemző alkaloidokat fermentativ úton is termelik fM. Abe, és munkatársai: J. Agric. Chem. Soc. (Japán) 25, 458 (1952) ]. Noha ez nem bírt ipari jelentőséggel, az alapváz bioszintózisének kutatásához sokáig megfelelő bázist jelentett [L.C. Vining és társai: Can. J. Microbiol. 12, 915 (1966); H.G.Floss: Tetrahedron 32, 873, 1976]. Az első ipari eljárást G.T.Banks és munkatársai dolgozták ki [J.Gen.Microbiol. 82, 345 (1974)]. Eljárásukban egy Pepniaetum typhoideum szklerociumából izolált, majd szelekcióval javított Claviceps fusiformis törzszsel agroklavint állítottak elő. Ezt követően Z.Rehacek állított elő új Claviceps purpurea mutánsokat. Az egyik mutáns zömében agroklavint termelő törzs volt. Két további mutáns zömében elimoklavint termelt néhány száz jug/ml összalkaloid szinttel [78.02516 és 78.02517 Bzámon közzétett csehszlovák szabadalmi bejelentések, illetve J.Nat.Prod. 44, 225 (1981) ]. A 735 010 számú szovjet szabadalmi leírás, illetve a Prikl. Biok. Mikrobiol 16, 569 (1980) egy, a természetben előforduló Claviceps fusiformis törzs alkalmazását ismerteti. Fermentációban a törzs jellemzően klavin-alkaloid termelő, és 6 különféle alkaloidot termel. Az össz-alkaloid szint 1220 ug/ml, s ezen belül megfelelően megválasztott táptalaj alkalmazása esetén 70-75% az elimoklavin mennyisége. S.H.Ambike és munkatársai [Phytochem. 9, 1953-58 (1970)] azt találták, hogy a klavin-alkaloidokat termelő Claviceps purpurea törzsek citokrom P-450-et tartalmaznak. Megfigyelték továbbá, hogy fenilbarbiturát adalékanyaggal növelni lehet a citokrom P-450 mennyiséget, és ezzel párhuzamosan növekszik a termelt összalkaloid mennyisége is. Kísérleteink során célunk volt, hogy nagy össz-alkaloid Bzintet biztosító, termelésre képes törzset tenyészünk ki, mely az össz-alkaloid mennyiségen belül lehetőleg főként elimoklavinl termel, esetleg attól könynyen elválasztható egyéb alkaloid(ok) mellett. Kiindulási törzsként egy olyan Claviceps fusiformis törzset választottunk, mely glicerin-pepton táptalajon főként agroklavint, és mellékalkaloidként elimoklavint termelt [A. Tonolo, és É. Udvardy-Nagy: Acta.Microbiol.Acad. Sei. Hung. 15, 29, (1968) ]. A törzset az OKI-nál 1977. május 2-án MNG 00164 számon deponáltuk. A kiindulási Claviceps fusiformis törzs - hasonlóan az Ambike által alkalmazott Claviceps purpurea törzshöz - tartalmaz alternáló oxidáz enzimet, nevezetesen citokrom P-450- et és a termelt összalkaloid-mennyiBég barbiturátokkal növelhető. Azt találtuk továbbá, hogy a barbiturát jelenlétében növesztett tenyészet telepmorfológiája, pigmentáltsága lényegesen eltér a kiindulási törzsétől. A szelekció ismétlésével ezen új morfológiai tulajdonságok oly mértékig stabilizálódtak, hogy azok a szelektált törzset az adalék jelenléte nélkül is jellemezték. Az új törzs - adalékmentes táptalajon - a kiindulási kultúrához képest magasabb citokróm P-450 tartalmat ért eh Az új törzs növekedése visszafogottabb, poliszaharid-képzése kisebb mérvű, alkaloid- és pigment termelése viszont fokozottabb, mint a kiindulási törzsé. Teljesen meglepő, hogy míg az anyatörzs főként agroklavint, addig az új variáns törzs főként elimoklavint termel. Az elimoklavin az agroklavintól egyszerűen elválasztható (pl. a 171 659 bz. magyar szabadalmi leírás szerint). Az új törzset az OKI-nál 1981. október 15-én MNG 00211 számon helyeztük letétbe. A találmány tárgya egyrészt új eljárás az I általános képletű klavin-típusú anyarozsalkaloidok - ahol R metil-, vagy hidroxi-metil csoportot jelent - előállítására Claviceps fusiformis törzzsel szén- és nitrogénforrást, ásványi BÓkat, valamint adott esetben egyéb adalékanyagokat tartalmazó folyékony táptalajon, alémerülő kultúrában, aerob körülmények között végzett fermentáció útján, oly módon, hogy termelő törzsként az MNG 00211-számon letétbe helyezett Claviceps fusiformis variáns törzset alkalmazunk. A találmány tárgya továbbá eljárás az MNG 00211 számon deponált új Claviceps fusiformis variáns törzs előállítására és fenntartására, oly módon, hogy az MNG 00164 számon deponált Claviceps fusiformis kiindulási törzset szén- és nitrogénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó agar-tartalmú szilárd táptalajon, és a táptalajon 1 literére számított 1-10 mmól mennyiségű barbituráttípusú adalékanyag jelenlétében 20-28 ®C hőmérsékleten 7-21 napig inkubáljuk, és a kapott, a kiindulási törzstől lilás színük és laposan elterülő alakjuk alapján jól megkülönböztethető telepeket szelektáljuk, és a szelekciót adott esetben barbiturát jelenlétében, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
