190129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karboxi-peptidáz b enzim elkülönítésére emlősők hasnyálmirigyéből
4 190129 5 kel biztosít megfelelő fajlagos aktivitású terméket. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogyha a sertés hasnyálmirigy homogenizátumát autolízis után hőkezelésnek vetjük alá, majd centrifugáljuk vagy szűrjük, a felülúszót valamely egyértókű kation szervetlen savval képezett sójával két lépésben telítjük és a második telítési lépés során kapott szuszpenzióból elkülönítjük a csapadékot, majd a csapadék oldatát vízzel szemben dializáljuk, hippuril-L-arginin szubsztráttal 25 °C-on mérve minimum 70 egység/mg fajlagos aktivitású enzimoldathoz jutunk, amely további tisztítás nélkül, közvetlenül felhasználható immobilizált karboxipeptidáz B előállítására. A találmány tárgya tehát új eljárás karboxipeptidáz B enzim elkülönítésére emlősök hasnyálmirigyéből. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy az emlős hasnyálmirigy önmagában ismert módon előállított homogenizátumát 37 °C-on, 1 óra hosszat vagy 25 °C-on 16 óra hosszat autolizáljuk, majd pH=5,0-8,5 pH-jú pufferrel 1:1 arányban hígítva 5-30 percig 50-75 °C-on hókezeljük, a hőkezelt elegyet centrifugáljuk vagy szűrjük, a felüluszóhoz literenként 10-80 g ammónium-szulfáttal kicsapjuk a karboxipeptidáz B enzimet tartalmazó aktív frakciót. A centrifugálással elkülönített enzimet vízben vagy pufferoldatban oldjuk és vízzel vagy pufferoldattal szemben dializáljuk, majd lefagyasztva tároljuk. A találmány szerinti eljárásban az emlős hasnyálmirigy autolizált hoinogenizátuinát 1:1 arányban hígítjuk pH=5,0-8,5 (célszerűen pH=6,0) pH-jú pufferrel, majd 5-30 percig 50-75 °C-on (előnyösen 60 °C-on 20 percig) hőkezeljük. Ezzel a hókezelési művelettel az elkülönítendő enzimet kisérő fehérjék nagy részét denaturáljuk. A denaturált fehérje nagyfelületű csapadék formájában válik ki a vizes oldatból és derítő hatása révén az oldatban maradt szennyezóanyagok nagy részét is magával ragadja. Ezáltal kiküszöbölhető a hasnyálmirigy acetonpor készítés nehézkes, költséges művelete. A denaturált fehérje elkülönítése után kapott pufferes oldatból 200-320 g/1 (előnyösen 310-320 g/1) ammónium-szulfáttal kicsapjuk a szennyező fehérjék egy jelentős részét. A szennyező fehérjéket tartalmazó csapadék eltávolítása után visszamaradó felülúszóból 10-80 g/1 (célszerűen 30 g/1) ammónium-szulfáttal kicsapjuk az enzimtartalmú terméket. A kivált csapadékot vízben vagy pufferoldatban oldjuk és az oldatot önmagában ismert módon vízzel szemben dializáljuk. Az így kapott enzimtartalmú termék 25 °C-on mórt aktivitása minimálisan 70 egység/mg, ami körülbelül 120-szoros tisztítási hatásfoknak felel meg. Ez a termék további tisztítás nélkül, közvetlenül felhasználható például immobilizált enzimkészítmények előállításához. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példu 0,25 kg sertés hasnyálmirigyet húsdarálón ledaráltunk, hozzáadtunk 250 ml 0,05 mólos Tris-HCl puffert (pH=7,0), és egy éjszakán át +4 °C-on állni hagytuk. Másnap a szuszpenziót 37 °C-ra melegítettük fel és 1 óra hosszat ezen a hőmérsékleten tartottuk. Ezután a szervszuszpenziót centrifugáltuk, a felülúszót 50 °C-ra melegítettük és ezen a hőmérsékleten inkubáltuk további 30 percig, majd hozzáadtunk 2 térfogat jeges puffert és centrifugáltuk. A felülúszóhoz 42,2 g ammónium-szulfátot adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk, a csapadékot eldobtuk, a felülúszóhoz - a pH=7,0-7,2-re állítása után - 36,1 g ammónium-szulfátol adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk. A csapadékot kevés hideg (+4 °C-os) Tris-HCl pufferben (pH=7,0) feloldottuk és desztillált vízzel szemben sómentesre dializáltuk. Dialízis után az oldatot szűrtük, majd lefagyasztottuk. Kitermelés: 343 mg karboxipeptidáz B. Specifikus aktivitás: 17,5 /umól hippuril-L-arginin hidrolízise(perc)mg fehérje. 2. példa 0,25 kg sertés hasnyálmirigyet húsdarálón ledaráltunk, hozzáadtunk 250 ml 0,05 mólos Tris-HCl puffert (pH=7,0) és egy éjszakán át +4 °C-on állni hagytuk. Másnup a szuszpenziót 37 °C-ra melegítettük fel és egy óra hosszat ezen a hőmérsékleten tartottuk. Ezután a szervszuszpenziót centrifugáltuk, a felülúszót 60 °C-ra melegítettük és ezen a hőmérsékleten inkubáltuk további 10 percig, majd hozzáadtunk 2 térfogat jeges puffert és centrifugáltuk. A felülúszóhoz 92 g ammónh:m-szulfátot adtunk. Mivel egy éjszakai állás alatt csapadék nem vált ki, az oldathoz - a pH=7,0-7,2-re állítása után - további 78,7 g ammónium-szulfátot adtunk. Egy éjszakai állás után a szuszpenziót centrifugáltuk. A csapudékot kevés hideg (+4 °C-os) Tris-HCl pufferben (pH=7,0) feloldottuk és desztillált vízzel szemben sómentesre dializáltuk. Dialízis után az oldatot szűrtük, majd lefagyasztottuk. Kitermelés: 295 g karboxipeptidáz B. Specifikus aktivitás: 53,1 jumól hippuril-L-arginin hidrolizise(perc)mg fehérje. 3. példa 0,25 kg sertés hasnyálmirigyet húsdarálón ledaráltunk, hozzáadtunk 250 ml 0,05 mólos Tris-HCl puffert (pH=7,0) és egy éjszakán 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
