189578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás marazin előállítására
1 189 578 2 hőmérsékleten sterilezzük. A sterilizált táptalaj pH- ja: 6,9. Ezt a steril táptalajt 2,0%, az 1. példában megadottak szerint előállított második fázisú inokulummal oltjuk be. A beoltott termelő táptalajt 10 1 térfogatú fermentorban fermentáljuk, 3 napon át, 30 °C hőmérsékleten. A fermentációs táptalajon 0,2 térfogat/táptalajtérfogat/perc steril levegőt vezetünk át, és hagyományos keverővei keverjük, ennek fordulatszáma percenként 400. 3. példa Izolálás és tisztítás 18 I fermentlevet elkülönítünk, és pH-ját 1 normál vizes kénsavval 3-ra állítjuk be. 1 órán át keverjük a szuszpenziót. Ezután szűrjük, a szűrést Hyflo Supercel szűrési segédanyag (diatomaföld, Johns- Manville Corporation) jelenlétében végezzük. A szűrési maradékot vízzel mossuk. Ezután 913% kálium-hidrogén-karbonátot tartalmazó metanollal extraháljuk a szűrési maradékot, az extrakciót 1 órán át való keveréssel végezzük. Ezután szűrjük. A szűrési maradékot 9 1 metanollal újraextraháljuk. Egyesítjük a metanolos extraktumokat, és 2 1- re töményítjük. A sűrítmény pH-ját 1 normál vizes kénsavval 7,5-re állítjuk be. Kétszer 2 1 etil-acetáttal extraháljuk az oldatot. Egyesítjük az extraktumokat, és csökkentett nyomású térben töményítjük. A desztillációs maradékot 150 ml acetonban oldjuk. 150 ml vizet adunk az acetonos oldathoz, pH-ját 1 normál vizes hidrogén-klorid-oldattal 3,0- ra állítjuk be. 1 órán át keverjük az elegyet. Szűréssel elkülönítjük az olajos kristályokat, és 150 ml acetonban oldjuk, az oldathoz 150 ml vizet adunk. Egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk az oldatot, a kivált kristályokat szűréssel elkülönítjük, vizzel mossuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután olyan kristályos anyagot kapunk, amely olajos filmmel borított. Az olajos kristályokat 5 ml benzolban oldjuk, és 1,8 x 40 cm méretű, szilíkagéllel (Grace Grade 62) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot benzollal egyenlítjük ki. A kromatográfiát 250 ml benzollal kezdjük, benzol és etil-acetát 9 : 1 arányú elegyének 250 ml-ével folytatjuk, majd 250-250 ml benzol-etil-acetát 4 : 1, 7 : 3 és 1 : 1 arányú elegyével folytatjuk, végül etil-acetáttal fejezzük be. 20-25 ml térfogatú frakciókat különítünk el. Az antibiotikum eluálódását biológiai értékméréssel és vékonyréteg-kromatográfiával követjük. A vékonyréteg-kromatográfiát szilikagél lemezeken végezzük, futtató-oldatként etil-acetátot használunk. Az előhívást vanilin-kénsav permettel vagy Bacillus subtilis mikroorganizmussal végezzük. Az egyetlen komponensként narazint tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomású térben szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot 50 ml acetonban oldjuk, 50 ml vizet adunk az oldathoz, ezt szobahőmérsékleten hagyjuk állni, a kristályosodás megindítására. A kivált kristályos anyagot szűréssel elkülönítjük és csökkentett nyomású térben szárítjuk. Ily módon fehér, kristályos anyagként 172 mg terméket kapunk, ennek olvadáspontja 75-78 °C. A kristályos anyag a mágneses magrezonancia spektroszkópiás, infravörös spektroszkópiás és ultraibolya spektroszkópiás, továbbá tömeg-spektrometriás, vékonyréteg- és papír-kromatográfiás vizsgálat szerint narazinnal azonos. A biológiai adatok, az antimikrobiális és anticoccidiális hatékonyság szintén azonos az autentikus narazin mintáival. Az A-39 912 mikroorganizmus által termelt bíborvörös színű kristályos anyag azonosítására a 4. példában megadott kísérleteket végezzük el. 4. példa Az undecil-prodiginin előállítása, azonosítása 23 cm x 45 cm méretű 10 mm magas sarkokkal rendelkező műanyag kromatográfiás lemezekre 250 ml paradicsom-paszta-zabliszt agart öntünk. Az eljárást Pridham és munkatársai szerint végezzük (Antibiot. Ann., 1956-1957, 947-953. oldal). A lemezeket 48 órás inokulummal oltjuk, az inokulumot tripton-élesztö-levesböl készítjük. Az oltást Shilling és Gottlieb (lásd előbb) keresztoltásos módszerével végezzük. A triptonélesztő-leves az alábbi összetételű. Összetevő Mennyiség (g/1) Trypton (Difco) 5,0 g élesztőkivonat 3,0 g desztillált víz 1,0 1-re feltöltve A táptalaj pH-ja autoklávozás előtt 7,0-7,2. Oltást követően a lemezeket 14 napon át, 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ezalatt az idő alatt az agáron bíbovörös színű kristályok keletkeznek. A bíborvörös színű kristályokat tartalmazó agart a periféria mentén kivágjuk az agárból, és négyszer 500 ml alábbi összetételű eleggyel extraháljuk: kloroform és metanol 4 : 1 arányú elegye. Az extrakciót keveréssel végezzük 15 percén át, jégfúrdő felett. Egyesítjük az extraktumokat, és csökkentett nyomású térben szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot 12 ml kloroformban oldjuk, az oldatot 1,2x52 cm méretű, szilíkagéllel (Grace 62) töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot kloroformmal készítjük el. Az eluálást is kloroformmal végezzük, 10 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A 34. frakció elkülönítése után az e'uáló oldószert kloroform és metanol 95 : 5 arányú elegyével cseréljük fel. Az eluálódó frakciókat szilikagél lemezen vékonyréteg-kromatográfiával vizsgáljuk, a futtatást kloroform és metanol 9 : 1 arányú elegyével végezzük. A megfigyeléskor a bíborszínű színanyagot keressük. A 9-14. frakciók tartalmazzák a legintenzívebb bíborszínü foltot adó anyagot (a vékonyréteg-kromatogrammon egyetlen foltot látunk), ezeket egyesítjük és szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékot dioxánban oldjuk és fagyasztva szárítjuk, ily módon 10,3 mg bíborszínü, poralakú termékhez jutunk. A termék nagyfeloldású tömegspektrometriával mért molekuláris tömegion-száma: 393,27764. Ta5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
