189552. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a D,L-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav szétválasztására enzimatikus úton
1 189 552 2 10 60 °C. előnyösen 20-40 °C, a reakcióidő a s/ubs/lrátum és a/ enzim koncentrációjától és az enzim aktivitásától függően 1^48 óra. Megfelelő enzimaktivitás érhető el 3-9, előnyösen 6-8 pH- értéknél A reakciót valamilyen foszfát-pufferban vagy puffer nélkül folytathatjuk le. A hordozóhoz kötött enzim alkalmazása esetén a reakciót végrehajthatjuk részletekben vagy oszlopeljárásban. Az oszlopeljárás során az oszlopban az álló fázist képező rögzített enzimen az N-fenacetil-L-PTC teljes dezacilezéséig folyamatosan vezetjük keresztül a szubsztrátumoldatot. A reakció befejeződését, illetve lefolyását polarimetriás módszerekkel vagy az irodalomból ismert kvantitatív analízis módszerrel (a képződött szabad aminosavnak ninhidrinnel történő átalakítása, majd spektrálfotometriás meghatározása) követhetjük. A nagy kitermeléssel előállított L-PTC forgatóképessége [ujj; = +28,5° (c=l. In HC1), amely legalább 90 t%-os (95 t% L-alak) optikai tisztaságnak felel meg. A következő kiviteli példák közelebbről mutatják be találmányunkat. /. példa 10 g (33.4 mmól) N-fenacetil-D,L-PTC-t kevés kétszer desztillált vízben szuszpendálunk, a reakcióelegv pH-értékét 1 n nátrium-hidroxid-oldattal 7.8-ra állítjuk be és a kapott oldatot kétszer desztillált vízzel 500 ml térfogatra egészítjük ki. A kapott reakcióelegyhez 15 mg E. coliból származó Penicillin-G-acilázt (aktivitása mintegy 2,9U/mg, szubsztrátum Penicillin-G-káliumsó, reakcióhőmérséklel 37 °C) adunk és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 15 óra elteltével ninhidrinnel végzett próbával meghatározzuk a szabad aminosav mennyiségét. Az átalakulás ennek alapján mintegy 50%-os. A reakcióelegyet ezután tömény sósav-oldattal 2-3 pH-értékűre savanyítjuk meg. szűrjük és a tiszta, vizes szubsztrátum-oldatot 150 g DOWFX,Rl 50 W x 2 (H -alak)-vel töltött oszlopon vezetjük keresztül. Az oszlopot vízzel mossuk, amig az eluátum semleges lesz és már nem mutatható ki benne klorid-ion. Ezt követően a szabad aminosavat 0.8 n sósav-oldattal etanol/víz (80 : 20) elegyével hidrokloridja formájában eluáljuk. Az eluátumot bepároljuk és így a tiszta PTC- hidrokloridot 199-200 °C olvadásponttal kapjuk. Kitermelés 3,3 g ( 15,2 mmól S 45,4 t%). A hidrokloridból ismert módon, mintegy kétszeres moláris mennyiségű propilén-oxidnak az etanolos szubsztrátumoldathoz való adagolásával a szabad kristályos L-aminosavat izoláljuk, olvadáspont 217-219 °C, [a]o = + 28* (c= 1, 1 n HC1). 2. példa 60 g (200,5 mmól N-fenacetil-D,L-PTC-t kevés vízben szuszpendálunk, pH-értékét nátrium-hidrox d-oldattal 8,0-ra állítjuk be, vízzel 1 1 térfogatra ti ütjük fel és 6 g rögzített Penicillin-G-acilázzal elegyítjük (aktivitása mintegy 80 U/g, szubsztrátum Penicillin-G-káliumsó, reakcióhőmérséklet 37 °C, a 5 hordozó előállítása 27 32 301 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat szerint). A reakcióelegyet 1,5 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd a szubsztrátum-oldatból kiszűrjük a vízben oldhatatlan katalizátort és a 10 szűrletet 750 g erősen savas kationcserélő gyantával töltött oszlopon vezetjük keresztül az 1. példában megadottakkal azonos módon, majd a reakciáelegyet feldolgozzuk. 20 g (92 mmól s 46 t%) L PTC-hidrokloridot kapunk, amelynek olvadás- 15 pontja 199-201 °C. A fajlagos forgatóképesség [a]f,2 = 23,3° (c = 0,6, ln HC1), ez [M]2D2 = 50,7° moláris forgatóképességnek felel meg. A propiléno? idős kezelés után kapott szabad L-PTC olvadáspentja 216-217 °C, fajlagos forgatóképessége 20 [álé2 = +28,5° (c=l, ln HC1), ez [M]2D2 = 51,6° m >láris forgatóképességnek felel meg. 25 3. példa A 2. példában alkalmazott hordozóhoz kötött Penicillin-G-aciláz N-fenacetil-D,L-PTC-vel szembeni stabilitásának vizsgálata céljából 100 mg rög- 30 zített enzimet 10 ml 5 t%-os vizes N-fenacetil-D,LPTC-oldattal (pH = 7,8, kevés foszfát-pufferrel stabilizált) elegyítünk és szobahőmérsékleten keverjük. 24 óránként a szubsztrátumoldatot szűrjük és az elválasztott, vízben oldhatatlan enzimet ismét 35 racém szubsztrátumoldathoz adjuk. Az enzimaktivitást ninhidrinnel 45 perc és 22,5 óra elteltével meghatározott szabad PTC-tartalom alapján számítjuk. 8 hét elteltével 45 perces reakcióidő után nem 40 tapasztaltuk a PTC-részarány lényeges csökkenését (a bevitt racemátra vonatkoztatva mintegy 20%). 22,5 óra után a bevitt racemát 50%-a hidrolizál. 45 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás a D,L-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav szétválasztására enzimatikus úton, azzal jellemezve, hogy a vegyület (I) képletű N-fenacetil-származé-50 kát 20-40 °C hőmérsékleten vizes közegben E. coliból származó Penicillin-G-acilázzal dezacilezzük és a reakcióelegyből az L-2-amino-4-metil-foszfinovajsavat ismert módon izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemez-55 ve, hogy Penicillin-G-acilázként E. coliból (ATCC 11 105) származó Penicillin-G-acilázt alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy szabad liofilizátum formájában 60 lévő Penicillin-G-acilázt alkalmazunk. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy hordozóhoz kötött Penicillin-G- acilázt alkalmazunk. 1 oldal rajz 3
