189548. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-4696 antibiotikum-komplex és egyes komponenseinek előállítására
1 . 189 548 2 felelő savakkal sókat képesek alkotni. Ezek az A-4696 antibiotikumból különíthetők el, amelyet úgy állítunk elő, hogy egy, az Actinoplanes missouriensis specieshez tartozó mikroorganizmust táptalajban addig tenyésztünk, amíg jelentős antibiotikus aktivitás nem mutatható ki. Az antibiotikum komponensekre vonatkozóan a következőkben bemutatott jellemző adatok a hidrokloridokra értendők, bár ismert módszerekkel más, farmakológiailag elfogadható sók is előállíthatok. A szilikagél-vékonyrétegkromatográfia (TLC), bioautográfia és a nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) arra mutat, hogy az A-4696 antibiotikum az elkülönítési eljárás során több olyan komponens keverékét szolgáltatja, amelyek antibiotikus aktivitást mutatnak. Az A-4696 antibiotikum komponenseknek nevezett A, B,, B2, B3, Cla, C3 és E, vegyület az A-4696 antibiotikumból poliamid oszlopon végzett kromatográfiával különíthető el. A kromatográfiás frakciókat UV-aktivitás és vékonyrétegkromatográfiás (TLC) eredmények alapján követjük, a tiszta A-4696 antibiotikum frakciókat tartalmazó, azonos viselkedésű kromatográfiás oldatokat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A kapott fagyasztva szárított kromatográfiás elegyek azonossága és tisztasága HPLC-vel határozható meg. Az A-4696 antibiotikum A komponensét korábban már elkülönítették, lényegében a 4 115 552 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint. Az erre a komponensre vonatkozó adatokat csupán azért mutatjuk be, hogy elősegítsük a többi új A-4696 antibiotikum komponens elkülönítésének és jellemzésének illusztrálását, amely komponensek előállítása a bejelentés tárgyát képezi. Az A-4696 antibiotikum bio-felülrétegzésével végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata, oldószerként 50 : 25 : 25 : 25 : 10 arányú metanol : kloroform : cc. ammóniumhidroxid : szekbutanol : víz elegyet és musként Bac. subtilist eredményeket adja: detektáló mikroorganizalkalmazva a következő A-4696 komponens Rr érték A 0,25 B, 0,35 b2 0,45 b3 0,40 c,a 0,51 Az A-4696 antibiotikum szobahőmérsékleten, oldószerként 90 : 10 arányú 2%-os vizes ecetsav : CHjCN és 70 : 30 arányú 2%-os vizes ecetsav : CH3CN elegy felhasználásával végzett nagynyomású folyadékkromatográfiája a következő eredményeket adja : A-4696 komponens R' érték A ,. * 1,60 B, 1,99 b2 3,84 A-4696 komponens R' érték b3 2,50 cu 2,92 c3 4,23 E, 4,38 A TLC és a HPLC alkalmazásával több más, kisebb mennyiségben jelenlevő komponens is elkülöníthető az A-4696 antibiotikumból. Ezeket a komponenseket C,h, Cu, C2h és D jelöléssel láttuk el; több vonatkozásban hasonlítanak az A-4696 antibiotikum A, B,, B2, B3, C,a, C3 és E, komponenséhez. Az A-4696 antibiotikum komplex ezenkívül tartalmazhat további, még nem azonosított komponenseket is. A kisebb mennyiségben jelenlevő komponenseket nem izoláltuk és tisztítottuk olyan mennyiségben, amely lehetővé tenné jellemzésüket. Ha az A-4696 antibiotikumot vagy az A-4696 antibiotikum egyes komponenseit enyhén savas körülmények között hidrolizáljuk (5%-os metanolos sósav, visszafolyatás, 70 perc), pszeudo-aglükon keletkezik. A pszeudo-aglükon kicsapódik a hidrolízis-elegyből és az A-4696 antibiotikum A, B„ B2, B3, Cla és C3 komponense esetében szerkezete az A) képlettel írható le. Az A-4696 antibiotikum E, komponense esetében lehetséges, de nem bizonyos, hogy ez a pszeudo-aglükon kissé módosult. Az A-4696 antibiotikum komplex és az egyes A-4696 antibiotikum komponensek hidrolíziselegye szűrletének papírkromatográfiás és TLC vizsgálata arra mutat, hogy a pszeudo-aglükon magon kívül a komplex és a komponensek egyaránt változó mennyiségű semleges cukrot tartalmaznak. Azt találtuk, hogy a semleges cukrok és ezek mólaránya az A, B,, B2, B3 és Cla A-4696 antibiotikum komponensek esetében a következő: 1. táblázat A semleges cukrok mólaránya Mannóz Glukóz Ramnóz A 2,80 1,0-B, 2,05 1,0 1,01 b2 1,80 1,0-b3 2,37 1,0-c,. 1,12 1,0 1,08 A cukrokat trimetil-szilil származékaik gázkromatográfiás elemzésével határozzuk meg. Az egyes cukrok az alfa- és a beta-izomer összegét jelentik. Az A-4696 komponenseket lényegében semleges cukor-komponensük alapján különböztethetjük meg, amely ismeretlen helyen kapcsolódik a pszeudo-aglükonhoz. Az A-4696 antibiotikum B, komponense hidroklórid formájában fehér kristályos vegyület, amely oldható vízben, hidroxiles és poláris oldószerekben, és oldhatatlan egyes oldószerekben, amilyen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
