189469. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganatellenes, ellenanyag-hatású ricin-A alegységet tartalmazó immunoglobulin-származékok előállítására
1 ! 189469 2 ri szervezetben erős antigenicitása van, és antixenogén immunoglobulin ellenanyag képződését idézi elő, amely semlegesíti a daganatellenes hatást, továbbá anafilaxiás sokkot okoz. A második hátránya az, hogy a diftéria toxin nem-specifikus toxicitása nem szűnik meg. Közelebbről megvilágítva a szóban forgó eljárásokat, ezek célja az, hogy a diftéria toxint a daganatsejtek felületén daganatellenes ellenanyag segítségével konjugálják; de mivel a konjugát a diftéria toxin teljes molekuláját tartalmazza, hajlamos arra, hogy kapcsolódjék az egészséges sejt diftéria toxint megkötő felületi receptoraival, és így citotoxikus hatással legyen az egészséges sejtekkel szemben. A harmadik hátrány a diftéria toxin és az ellenanyag közötti keresztkötések kialakításában rejlik. A keresztkötések kialakulását elősegítő szerek, például a glutáraldehid, a toluoldiizocianát, a dietil-malonimidát, a klórambucil stb. - közül sok kötéseket hoz létre nemcsak az ellenanyag és a toxin között, hanem az ellenanyag és ellenanyag, illetve toxin és toxin között is, továbbá ezek a szerek a toxin- és az ellenanyag-molekulában intramolekuláris kötéseket alakítanak ki, így nemkívánatos termékek keletkezését okozzák, valamint csökkentik vagy megszüntetik a daganatellenes hatást. Kutatásaink arra irányultak, hogy leküzdjük az eddig ismert megoldások hátrányait. Ennek eredményeképp kifejlesztettünk egy daganatellenes szert, amely erős citotoxikus hatását a daganatsejtekkel szemben szelektíven fejti ki. Felismerésünk alapján a találmány tárgya eljárás az I általános képletű daganatellenes immunoglobulin-származékok, ahol az I általános képletben a Fab-fragmentum anti-L-1210 immunoglobulint jelent ; az RA-fragmentum a ricin A alegységét jelenti; X jelentése a (4), (5), (6), (7), (8) és (9)-képletű csoport - ahol k jelentése 2-15-ig terjedő egész szám -, Sj és S2 egyaránt kénatomot jelent, melyek közül S! egy immunoglobulinben lévő diszulfid kötésből (—S—S—) származó kénatomot, míg S2 a ricinben lévő diszulfid kötésből származó kénatomot jelent; n értéke 0, vagy 1; előállítására, amely abban áll, hogy a) olyan I általános képletű vegyületek előállítása esetén, amelyek képletében n értéke 0, egy daganatellenes immunoglobulin legalább egy S-szulfocsoportot (—S—S03—) vagy V általános képletű aktív diszulfid-hidat tartalmazó - az V általános képletben Z jelentése (1), (2) vagy (3) képletű csoport - Fab-fragmentumot ricin legalább egy tiolcsoportot tartalmazó A alegységével reagáltatjuk, vagy b) olyan I általános képletű vegyületek előállításakor, amelyek képletében n értéke 1, egy daganatellenes immunoglobulin legalább egy tiolcsoportot tartalmazó Fab-fragmentumát egy legalább két funkciós csoportot tartalmazó térhálósítószer, előnyösen egy III általános képletű vegyület - ahol a képletben Y jelentése fenilén-, —CH2—O—CH2— vagy (10 képletű csoport - vagy egy IV általános képletű vegyület - ahol a képletben Z jelentése —NH—(CH2)k—NH-csoport, ahol k jelentése a fenti és és X2 halogénatomot jelent jelenlétében ricin legalább egy tiolcsopc'-tot tartalmazó A alegységével reagáltatjuk. A találmány szerinti eljárás abban a!' hogy az említett Fab fragmens kénatomját kö^ -tlenül 5 vagy közvetve összekapcsoljuk az említett \ ai ’ység kénatomjával. Az alábbiakban magyarázatot fűzünk az ábrák hoz. Az 1. ábra egy-egy képszerű mintán bemutatja 10 (a) az immunoglobulin alapszerkezetét és (b) az IgGl humán immunoglobulin szerkezetét. A 2. ábra egy-egy mintán képszerűen bemutatí ■ (a) a ricin szerkezetét és (b) az A és B alegység ’ szerkezetét. !5 A3, ábra nátrium-dodecil-szulfát/poli(akril-amid) géllel végzett elektroforézisre mutat be példákat. Az 1 lemez a F(ab’)2-t, a 2 lemez a Fab’-t, a 3 lemez az A alegységet, a 4 lemez az A alegység egy polimerjét, míg az 5 lemez a Fab’ és az A alegy- 20 ség reakcióelegyét (1. példa) mutatja be. A 6 lemez a 4. ábra I csúcsát, a 9 lemez egy F(ab’)2-ből és I csúcsból álló keveréket, a 10 lemez egy A alegység polimerjéből és I csúcsból álló keveréket, míg a 11 lemez egy olyan terméket mutat, amelyet az 25 I csúcsnak megfelelő fehérjének 2-merkaptoetanollal való kíméletes redukálásával kaptunk. A 4. ábra egy eluálási mintát mutat be, melyet Sephadex G150-es oszlopkromatográfiás eljárással kaptunk, amelyet anti-L 1210 immunoglobulin 30 Fab’ fragmenséből és ricin A alegységéből álló reakcióeleggyel végeztünk el. Az ábrán a találmány szerinti fehérje-hibrid a bevonalkázott tartományba esik. Amit a leírásban daganatellenes immunoglobu- 35 linnak nevezünk, az egy olyan fehérje (immunoglobulin), amely ellenanyag hatással rendelkezik, és amelyet például egy rákos beteg szérumából vagy olyan állatok szérumából (majmok, lovak, tehenek, kecskék, birkák, nyulak stb.) állítunk elő, melyeket 40 ráksejtekkel vagy rák antigénnel hiperimmunizáltunk. A hiperimmunizálást közismert eljárásokkal végezzük el (például Cohn-féle etanolos frakcionálással, ammónium-szulfátos frakcionálással, ioncserélős kromatográfiás eljárással stb.). Vagy a da- 45 ganatellenes immunoglobulin egy olyan fehérje, amelynek ellenanyag hatása nagy szelektivitású az olyan rák antigénnel szemben, amelyet hibridómák táptalajából vagy hibridómákkal beoltott állatok hasvizéből nyerünk ki. A hibridómákat úgy állítjuk 50 elő, hogy rák antigénnel vagy ráksejtekkel immunizált állatokból kinyert ellenanyag-termelő lymphocytákat egyesítünk például myelomás sejtekkel [például lásd: H. Koprowski és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 75, 7. szám, 3405-3409 55(1978/; Herlyn és munkatársai, ibid., 76, 1438-1442 /1979/; M.-Y. Yeh és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 76, 6. szám, 2927-2931 /1979/; R. H. Kennet és munkatársai, Science, 203, 1120-1121 /1979/]. A találmány értelgQmében a daganatellenes immunoglobulinok közé soroljuk azokat a fehérjéket is, amelyek ellenanyag hatással rendelkeznek, és amelyeket úgy állítunk elő, hogy daganatszövetből egy denaturáló szerrel - például felületaktív szerrel - elkülönítünk egy 3
