189407. lajstromszámú szabadalom • Eljárás poliferáló növényi sejtformációk előállítására
1 189 407 2 5-10 000-szeres, különösen 2-100-szoros térfogatú, növénysejtszaporitásra alkalmas tápoldatba helyezzük és a tenyésztést mindkét esetben 0-40 °C hőmérsékleten, a kívánt nagyságú sejtformációk eléréséig folytatjuk. A sejtformációk tenyésztéséhez különösen előnyös hőmérséklet a 12-30 °C. Az érdeklődés előterében a protoplasztokból származó növények technikai-ipari tenyésztése áll. Az új eljárásnál célszerűen a mikroorganizmusok szaporítására szokásosan használt lemezes tenyésztő módszert úgy módosítjuk, hogy az ismert módon izolált, sterilezett és tisztított protoplasztokat agar helyett agarózzal szilárdított (táp)közegben veszszük fel, a protoplasztokat benne egyenletesen diszpergáljuk és a protoplasztokkal így beoltott és agarózzal gélesített közeget kisebb, előnyösen egyenletes szegmensekre osztjuk fel, e szegmenseket egyenként vagy együttesen megfelelő tápoldattal részben megtöltött tartályba helyezzük és azt az említett hőmérsékleteken, adott esetben sötétben, egyenletesen addig rázatjuk, amíg kívánt nagyságú sejtformációk vagy embrionális, életképes növénykék képződnek. A sejtformációkkal átjárt agarózszegmensek kiválóan alkalmasak bioreaktorokban való ipari szintű továbbtenyésztésre, értékes alkotórészek kinyerése céljából. Embrionális növénykék érett növényekké, például előnyös tulajdonságokkal rendelkező hibridnövényekké tenyészthetők és biológiailag normális úton továbbszaporíthatók. A „szegmens” kifejezést helyettesítőleg alkalmazzuk itt háromdimenziós, szokásosan azonos nagyságú képződményekre, melyek szabálytalan vagy előnyösen szabályos térbeli kiteijedésűek, például hasábok, gömbök, kockák, prizmák, kúpok és hasonlók lehetnek; közepes átmérőjük körülbelül 1-100 mm, előnyösen körülbelül 2-60 mm, különösen 2-10 mm. A sejtformációk fermentorokban történő ipari továbbtenyésztéséhez különösen a közepes átmérőjű, gömb alakú szegmensek alkalmasak. A találmány szerinti eljárás hatékonyabb számos ismert eljárásnál, különösen nehezen kezelhető illetve érzékeny protoplasztokból származó sejttenyészetek előállításánál. Az eljárás egyszerűen hajtható végre és úgy különféle eredetű protoplasztokhoz, mint fuzionált, valamint génmanipulált protoplasztokhoz alkalmazható. A bevezetőben leírt egy vagy több előnyös tulajdonsággal rendelkező növényi sejtkultúrák szelektív tenyésztésére alkalmas. Ezenfelül daganatszövetből nyert protoplasztokhoz is használható. Agaróznak növényi sejtek illetve sejttelepek tenyésztésére való alkalmazása tehát a találmány szerint eljárás alapvető része, ugyanakkor mindegy, milyen agarózfajtát használunk, minthogy a különböző agaróztípusok a találmány szerinti felhasználásuk szempontjából csak fokozatokban térnek el egymástól és az agárhoz viszonyítva lényegesen alkalmasabbak protoplasztokból nyert növényi sejtformációk tenyésztéséhez. Bár az alábbi 1-5. példa kísérleti eredményei már kétséget kizáróan mutatják, hogy protoplasztokból nyert növényi sejttenyészeteknél az agaróz minden esetben felülmúlja az agart, a gyakorlatban agaróz alkalmazásakor is jelentkezik bizonyos probléma. Egyes esetekben ugyanis megfigyelhető, hogy egy előrehaladott fejlődési fázisban a sejtformációk képződése leáll, sőt elhalás is bekövetkezik : az elsőként említett jelenség valószínűleg a táptalaj bizonyos kimerülésére vagy kilúgozódására, az utóbbi pedig a növekedő sejtformációk mérgező kiválasztási tenné keinek felszaporodására vezethető vissza. Meglepő módon azonban mindkét nemkívánatos hatás egyszerű módon kiküszöbölhető. Ha ugyanis az agarózzal szilárdított és protoplasztokkal beoltott primer táptalajt kisebb, előnyösen egyenletes nagyságú illetve formájú szegmensekre osztjuk fel és e szegmenseket például rázótartályban, előnyösen nagyobb térfogatú, alkalmas tápfolyadékkal átöblítjük, akkor a sejtformációk akadálytalan növekedése figyelhető meg. Ugyanakkor bizonyos körülmények között előnyös, ha a protoplasztfajtától függően az agarózzal megszilárdított táptalaj szegmentálását a protoplasztokkal való beoltást követő 0-7 nap, a legtöbb esetben 3-4 nap múlva hajtjuk végre Petúnia-protoplasztok esetében a beoltás utáni 4. nap, dohánynál és Crépis capillaris-nál a 3. nap bizonyult a legmegfelelőbb időpontnak. Brassica rapa protoplasztoknál a szegmentálást legjobb az agaróz gélesedése után azonnal elvégezni. Az agaróznak szilárdító táptalajként való alkalmazása mellett a találmány fontos részét képezi az agarózzal megszilárdított és a protoplasztokkal beoltott táptalaj alkalmas szegmensekre való feldarabolása. A találmány körébe tartoznak a leírt eljárással nyert sejtformációk illetve növények is. A találmány szerinti eljárás keretében alkalmazott tápoldatok a sejtnövekedés gyorsítása céljából szerves vegyületek nyomait is tartalmazhatják, mint például vitaminokat, szénforrásokat, mint nádcukrot és glükózt, fitohormonokat, mint auxint és citokinint, és természetes kivonatokat, mint malátakivonatokat vagy kókusztejet és szükség esetén egyéb adalékokat. A tenyésztési illetve inkubálási körülmények, mint például a táptalaj hőmérséklete, fényhatás és az inkubálás illetve továbbtenyésztés időtartama, a mindenkori adottságokhoz, mint a növény- illetve protoplasztfajtákhoz, vagy a kísérlet méretéhez alkalmazkodnak. A használható protoplasztok nyerését az alábbi a-c. előírásokban részletesen leírjuk, de a szóban forgó sejttenyészet a növény tetszőleges szervéből vagy szövetéből, például a gyökerekből, szárakból, levelekből, virágokból, magokból, pollenből és hasonlókból, például kallusz (sebkéreg) tenyészetekből is származhat. A protoplasztok előállítására szolgáló módszerek általánosan ismertek és nem korlátozódnak az a-c. előírásokban megadottakra. Előírások tiszta protoplasztok előállításához a) Előírás: 0,25 M szorbitot, 0,025 M CaCl2 • 2- H2Ó-t és 0,5% [w/v] 2-/«-morfolin-etánszulfonsavat (MES) tartalmazó, 5,2 pH-jú oldatban 4% [w/v] celluláz Onozuka R. 10-et (Yakult Co. Ltd. Japán), 2% [w/v] drizelázt (Chemische Fabrik Schweizer-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
